人精子IZUMO蛋白的制备与人抗精子抗体间接ELISA检测方法的建立

刘雨晴，王鑫，刘凤辉，罗厚龙，徐军发

不孕不育是指夫妻在婚后至少同居一年，有正常性生活，未采取任何避孕措施而不能生育的状态[1]。世界卫生组织（WHO）的调查数据显示，全世界有 6000 万～8000 万夫妇处于不育不孕的状态，并且由于环境、激素和相关疾病等因素的影响，不孕不育夫妇的数量日益增多[2-3]。据统计，在所有引起不孕不育的原因中，免疫学因素所致的不孕不育症占 10%～28%[4-5]。免疫性不孕不育是指由于生殖系统抗原的自身免疫或同种免疫引起的不孕不育症。据报道，79% 的不明原因的不孕妇女体内有抗精子抗体（ASAb）；在不孕不育症患者中，16% 的男性患者和 29% 的女性患者体内含有抗精子抗体，女方抗体发生率较男方高，强阳性者较 多[6]。

精子可以成为自身抗原和同种抗原，精子抗原可以使人体产生抗精子抗体。精子多肽抗原有很多种[7-9]，其中 IZUMO 蛋白在精子表面特异性表达，精子顶体反应后可以与抗 IZUMO 抗体结合，而没有发生顶体反应的精子表面没有 IZUMO 蛋白[10]。当体内产生抗 IZUMO 抗体，精子和卵细胞的结合会受到阻碍，受精卵无法形成[11]。

IZUMO 蛋白含有 377 个氨基酸，分为大片段胞外区域、跨膜区域和小片段胞内区域，胞外区域包含 319 个氨基酸[12]。IZUMO 蛋白在哺乳动物中具有高度保守性，IZUMO 蛋白可分为 PA、PB、PC 三个区域，其中 PB 中的免疫球蛋白样结构域（Ig-like domain）具有强烈的免疫原性，是使机体产生抗体的主要区域[13]，IZUMO 蛋白 PB 中的免疫球蛋白样结构域（氨基酸 167～253）是影响精子和卵细胞结合的重要片段。

检测抗精子抗体的方法有很多种，不同的方法，其敏感性、特异性及重复性有所不同[14-15]。ELISA 具备耗时短、可以大批量检测、费用低、技术成熟等优点，目前在国内外广泛应用。

1 材料和方法

1.1 材料

目的基因引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；质粒 pET30a、菌株E.coliBL21 购于北京天根生化科技有限公司；限制性内切酶NdeI、HindIII 和 rTaqDNA 聚合酶购于日本 Takara 公司；PCR 扩增试剂盒购于生工生物工程（上海）股份有限公司；DNA 回收试剂盒、质粒提取试剂盒、人 IgG 标准液、终止液购于北京索莱宝科技有限公司；Ni2+-NTA 凝胶层析柱购于美国 GE 公司；His-tag 小鼠单克隆抗体 IgG 购于上海碧云天生物技术有限公司；IPTG 购于北京鼎国生物工程有限公司；96 孔酶标板购于美国 Costar Inc 公司；辣根过氧化物酶标记的鼠抗人单克隆 IgG、TMB 一步法显色剂购于美国 Thermo Fisher 公司。收集 2017年8 - 12月在东莞东华医院生殖中心的 180 例血清标本，其中健康孕妇血清 90 例、不孕妇女血清 90 例。

1.2 方法

1.2.1 人精子 IZUMO 蛋白基因序列的合成及重组质粒的构建 考虑到 IZUMO 蛋白的结构特征，选择 IZUMO 的 Ig 样结构域作为抗原，并选择大肠杆菌表达系统 pET30a 用于表达具有 6 × His 的重组人 IZUMO。根据 NCBI 基因库（ID284359）人 IZUMO 的碱基序列和大肠杆菌表达系统的密码子偏好，对目的序列进行了修饰，插入酶切位点NdeI、Hind III 以及 6 × His 组氨酸标签，人工合成重组人 IZUMO 基因序列，其上下游引物分别是：IZUMO-P1 5' GGCATTCGACGACAGCAGGACTCC 3'；IZUMO-P2 5' GACCGACACTAAGTTTGCATGGCC 3'。PCR 扩增目的基因，反应条件具体为：94 ℃ 预变性 5 min；94 ℃ 变性 40 s，60 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 45 s，30 个循环；72 ℃ 延伸 10 min。将酶切后的目的基因 PCR 片段和经过双酶切的载体 pET30a 大片段加入到 1.5 ml EP 管中，再加入 T4 DNA 连接酶，轻轻混匀后 16 ℃ 连接过夜。将扩增后的目的基因克隆到 pET30a 载体构建人 IZUMO 表达质粒（pET30a-IZUMO-His）。双酶切分析和 DNA 测序鉴定 IZUMO 基因及重组质粒。

1.2.2 重组 IZUMO 蛋白的表达、纯化与鉴定 将含有正确 IZUMO 基因序列的菌液接种于含有 50 μg/ml 卡那霉素的液体 LB 培养基，37 ℃、200 r/min 摇床培养过夜。当菌液培养至OD600值约 0.6 时，用浓度为 1 mmol/L 的 IPTG 诱导，分别于 15 ℃ 诱导 16 h，37 ℃ 诱导 4 h。10 000 ×g离心 20 min 后收集菌体，超声破碎，进行 SDS-PAGE 电泳和 Western blot 来确定蛋白是可溶性表达还是包涵体表达。根据实验，发现大部分目的蛋白存在于包涵体中。因此，将菌液扩大培养，收集包涵体提取蛋白，用含有镍柱树脂的层析柱进行蛋白纯化，对纯化后的样品进行 SDS-PAGE 电泳分析，SDS-PAGE 电泳后的蛋白凝胶进行转膜并用 Western blot 检测目的蛋白，加入稀释浓度为 1:1000 抗 His-tag 小鼠单克隆抗体，室温孵育 1 h；洗涤后，加入稀释浓度为 1:1000 的 HRP 标记的兔抗鼠 IgG，室温孵育 1 h，曝光后在凝胶成像仪中拍照，分析免疫反应条带。

1.2.3 基于重组 IZUMO 蛋白的间接 ELISA 方法的建立以及临床样本的初步检测 间接 ELISA 方法具体实验步骤有：包被、封闭、加样品、加一抗、加酶标二抗、显色、终止、比色。

用棋盘滴定法确定抗原包被浓度、最佳抗原包被液、最佳包被时间、最佳封闭液、最佳封闭条件、阳性标准品最佳稀释浓度、最佳二抗工作浓度、最佳显色时间等。优化该方法的条件后，用 IZUMO 标准抗体，分别用同一试剂板和不同时间包被的试剂板进行检测，评价 IZUMO 抗体间接法检测试剂盒的重复性。

用优化的间接 ELISA 方法对收集的 90 位正常孕妇血清和 90 位临床诊断为不孕的患者血清进行检测，制作 ROC 曲线，评价该方法的特异性与敏感性。

2 结果

2.1 人精子 IZUMO 蛋白基因序列的合成及重组质粒的 构建

从 NCBI 获得人 IZUMO 基因序号：Gene ID284359，同时获得人 IZUMO 具体碱基序列。IZUMO 基因经插入修饰后全长为 384 bp，经NdeI、HindIII 双酶切为 41 bp 和 302 bp 两个片段（图1），连接到载体构建重组质粒。重组质粒 pET30a-IZUMO-His 分子量约为 5714 bp，经NdeI、HindIII 双酶切为 5422 bp 和 302 bp 两个片段（图2）。将构建成功的质粒转化E.coliBL21 菌种，体外扩增并测序（图3），目的碱基序列与 IZUMO 蛋白基因序列符合度高达 100%，测序正确的菌种可用于接下来的蛋白表达。

图1 Nde I、Hind III 双酶切鉴定 IZUMO 基因

图2 Nde I、Hind III 双酶切鉴定 pET30a-IZUMO-His 重组质粒

图3 阳性克隆菌 pET30a-IZUMO-His 质粒碱基序列匹配度

图4 纯化、鉴定重组人 IZUMO 蛋白（A：重组 IZUMO 蛋白在 BL21 表达的 SDS-PAGE 分析；B：纯化重组 IZUMO 蛋白 SDS-PAGE 分析；C：重组 IZUMO 蛋白在 BL21 表达的 Western blot 分析；D：纯化重组 IZUMO 蛋白 Western blot 分析）

2.2 重组 IZUMO 蛋白的表达、鉴定

重组质粒转化菌种后，获得含有目的重组质粒的工程菌，IPTG 诱导工程菌表达相对分子质量为 10.7 kD 的蛋白，与含有 6 × His 的重组蛋白的预期分子量大小相符 （图4A）。工程菌用 IPTG 在 37 ℃ 诱导 4 h，可高效表达重组 IZUMO 蛋白，且重组 IZUMO 主要存在于细胞裂解液沉淀物中，可溶性表达较少。用 His-tag 抗体进行 Western blot 分析发现工程菌裂解产物的沉淀中含有大量相对分子质量为 10.7 kD 的蛋白（图4C）。综上，工程菌在 37 ℃ 经 IPTG 诱导 4 h 后可高效表达不可溶性 IZUMO 蛋白。蛋白经镍柱纯化后，纯度可到 97% 以上，用 SDS-PAGE 电泳和 Western blot 对蛋白进行再次鉴定（图4B 和 4D）。重组 IZUMO 蛋白可成功大量表达，纯化后的重组 IZUMO 蛋白可用于后期的间接 ELISA 实验方法的建立。

2.3 基于 IZUMO 重组蛋白的间接 ELISA 方法的建立

通过对各组分的摸索和研究，当阳性OD值接近 1，且阴性OD值小于 0.2，P/N 值较大，阴性对照较小时，最终建立的间接 ELISA 方法如下：抗原最佳包被浓度为 5 ng/ml、最佳抗原包被液为碳酸钠缓冲液、最佳包被时间为 12～16 h、最佳封闭液为 3% 脱脂奶粉的 PBST、最佳封闭条件为 37 ℃ 2 h、阳性标准品最佳稀释浓度为 1:100、二抗最佳工作浓度为 1:5000、最佳显色时间为 20 min。

2.4 基于 IZUMO 重组蛋白的间接 ELISA 方法的重复性 评价

在同一包被板中检测同一浓度 IZUMO 抗体标准品（1:1000 稀释度），做 10 个复孔，计算复孔平均值、标准差、变异系数，批内重复性试验 CV 值小于 0.05。此外，在不同时间包被 5 板该试剂盒，用于检测 1:1000 稀释度的 IZUMO 抗体，计算 5 板均值、标准差、变异系数，结果显示批间重复性试验变异系数也小于 0.05，该 ELISA 检测方法的重复性良好（表1）。

表1 IZUMO 抗体间接法检测试剂盒重复性评价

2.5 临床标本初步检测及 ELISA 方法的特异性和敏感度

用上述优化的间接 ELISA 方法对收集的 90 位正常孕妇血清和 90 位临床诊断为不孕的妇女血清进行检测，OD值作 ROC 曲线（图5），当 cut off 值为 3 时，该诊断方法的敏感度为 15.6%，特异性为 100%，曲线下面积为 0.945，差异有统计学意义（P＜ 0.01），说明该方法有一定的诊断价值。

图5 间接 ELISA 检测人血清 IZUMO 蛋白 ROC 曲线

3 讨论

抗精子抗体的检测对于不孕不育的诊断具有重要的临床意义，而以重组人精子 IZUMO 蛋白为抗原的 ELISA 试剂盒，理论上既可以高效特异性捕获女性不孕不育患者血清中的抗 IZUMO 抗体，又可以大批量操作，有望成为临床检测不孕不育的有效试剂盒。临床上已经有很多抗精子抗体试剂盒，但是据报道，国内试剂盒灵敏度低，特异性差，无法满足临床诊断需求，错误判断患者病情。国外试剂盒检出率为 21.5%，符合文献报道的 10%～30%[16]，但是价钱昂贵，无法推广。且目前国内外并没有将重组 IZUMO 蛋白研制成试剂盒的报道，也没有相关专利。本研究通过制备重组人精子 IZUMO 蛋白，成功建立并优化了基于该蛋白的人抗精子抗体的间接 ELISA 检测方法，建立了一种特异性好、价钱便宜的人抗精子抗体检测方法。

利用优化后的试剂盒对健康孕妇与不孕患者进行检测，发现该方法的敏感度为 15.6%，特异性为 100%，提示该方法有一定的初步诊断价值。该方法敏感度低的原因可能是由于 IZUMO 抗体并非存在于每一位不孕患者外周血血清中，且导致不孕的原因有多种，免疫学因素所致的不孕不育症仅占 10%～28%[4-5]。因此该方法在筛查临床不孕不育时应结合其他抗精子抗体的检测方法。接下来仍需进一步优化该试剂盒，并扩大临床样本，验证上述试验结果。若该方法具有临床诊断价值，可纳入更多患者，评价该试剂盒用于诊断不孕不育的灵敏度和特异性等临床诊断效能。