miRNA-1297通过靶向BH3结构域凋亡诱导蛋白促进肝细胞癌的进展

陶元平，王丽萍，杨远，黄智平，倪俊声，周伟平

肝细胞癌（HCC）是世界范围内常见的恶性肿瘤之一，尤其是在中国[1]。但由于其发病过程复杂，目前其发病机制尚不完全清楚。肝癌的临床治疗效果非常有限，手术仍是最常用的治疗方法。然而，低治愈率和手术后高复发率降低了手术的疗效[2-3]。因此，迫切需要进一步研究肝细胞癌的发病机制和发现潜在的治疗靶点以期实现对肝细胞癌的个体化靶向治疗。

microRNAs（miRNAs）是一类在真核生物中广泛存在的长度为 20～22 个核苷酸的内源性非编码 RNA。这些分子大约占整个人类基因组的 1%，在各种组织中广泛表达[4]。miRNAs 可以直接靶向靶基因的 3'-非翻译区（UTR），从而抑制这些基因的翻译或诱导降解。研究证实 miRNAs 在包括细胞增殖、分化、凋亡和迁移在内的多种重要的生物学过程中发挥着重要作用。因此 miRNAs 在肿瘤的发生和进展中扮演重要角色，并可能作为潜在的治疗靶点[5-8]。目前已经证实 miR-361[5]、miR-122[9]和 miR-199[10]等异常表达的 miRNAs 参与了肝癌的发生和进展。最新的研究证实，miR-1297 与多种癌症联系紧密，包括胃癌[11]和胰腺癌[12]。本研究证实 miR-1297 在肝癌组织中的高表达与患者的不良预后显著相关，并重点关注了 miR-1297 在肝细胞癌发展过程中的作用以及相应的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本 109 对 HCC 组织和其匹配的癌旁组织来自 2013年1月- 2015年12月海军军医大学附属东方肝胆外科医院进行根治手术的肝细胞癌患者。癌旁组织距离癌灶边缘超过 5 cm。标本和相应的邻近组织来自同一肝癌患者。由本院拥有 5年以上经验的病理医师检查每个组织样本 并确认组织类型。术后肿瘤组织立即冻存于 -80 ℃ 液氮中以备后用。患者在手术前没有接受任何治疗。本研究经海军军医大学附属东方肝胆外科医院伦理委员会批准且所有患者均签署知情同意书。

1.1.2 细胞系 人肝细胞癌细胞系 SMMC-7721 和 HepG2、人肝细胞系 QSG-7701 和 HEK293 购自中国科学院细胞库。

1.1.3 试剂 胎牛血清购自美国 Gibco 公司；DMEM 培养基和 lip2000 购自美国 Invitrogen 公司；miR-1297 阴性对照、抑制剂或模拟物购自广州市锐博生物科技有限公司；报告基因购自上海吉马生物制药有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞系培养与转染 将 SMMC-7721、HepG2、QSG-7701 和 HEK293 细胞培养在含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基中，在 37 ℃ 置于 5% CO2中。将 2.5 × 105SMMC-7721 或 HepG2 细胞接种于 6 孔板中培养过夜，然后用 50 nmol/L miR-1297 阴性对照、抑制剂或模拟物根据产品说明书，使用 lip2000 进行转染。

1.2.2 qRT-PCR 检测 具体实验操作过程依照参考文献[13]，U6 为内参基因。用 2-ΔΔCT方法分析 miR-1297 的相对表达情况。

1.2.3 细胞增殖和凋亡实验 具体实验操作过程依照参考文献[13]。

1.2.4 双荧光素酶报告基因分析 具体实验操作过程依照参考文献[13]和试剂说明书进行。

1.2.5 蛋白质印迹分析 具体实验操作过程依照参考文献[13]。所用抗体 BID（ab32060）、Anti-Bid Cleavage Site（ab108293）、cytochrome C（ab13575）和 gapdh（ab8245）。

1.3 统计学处理

采用 SPSS 18.0 版进行统计分析。Kaplan-Meier 生存分析法用于肝细胞癌患者的生存资料分析，并用对数秩检验进行显著性检验。t检验来比较两组的数据，当P＜ 0.05 时，认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-1297 在肝细胞癌中显著上调表达

为了研究 miR-1297 在肝细胞癌中的表达情况，通过 qRT-PCR 分析了 109 对肝癌组织和匹配的癌旁组织中 miR-1297 的表达水平，结果提示其在肝细胞癌中显著上调表达（图1A）。qRT-PCR 结 果证实，相对于肝细胞系 QSG-7701，miR-1297 在肝癌细胞系 SMMC-7721 和 HepG2 中的表达也明显上调（图1B）。为了评估 miR-1297 表达与预后的关系，将 109 例肝细胞癌患者的组织样本按照 miR-1297 的中位表达分为高/低两组。生存曲线显示，在肝细胞癌组织中 miR-1297 的高表达与患者不良预后显著相关（图1C 和 1D）。

2.2 抑制 miR-1297 降低肝癌细胞增殖能力

研究了 miR-1297 在肝细胞癌进展中的潜在作用。首先将 miR-1297 抑制剂转染至肝癌细胞系 SMMC-7721 和 HepG2 中，通过 qRT-PCR 证实 miR-1297 在转染后的肝癌细胞系中显著下调表达（图2A）。细胞增殖实验证实降低 miR-1297 表达可以显著抑制肝细胞癌细胞的增殖能力（图2B）。以上结果提示 miR-1297 在体外可以增强肝细胞癌细胞的增殖能力。

2.3 抑制 miR-1297 促进肝癌细胞凋亡

本研究还检测了 miR-1297 在调节肝癌细胞凋亡中的作用，实验结果证实抑制miR-1297 的表达可促进肝癌细胞的凋亡（图2C）。以上数据表明在肝细胞癌中高表达的 miR-1297 可抑制肝癌细胞凋亡。

2.4 miR-1297 直接靶向 BID

为了探索 miR-1297 促进肝癌细胞进展的分子学机制，利用在线软件 TargetScan 7.2 预测 miR-1297 的潜在结合靶点。在被预测的所有靶基因中，发现 BH3 结构域凋亡诱导蛋白（BH3 interacting domain death agonist，BID）（Bcl2 家族成员）与细胞凋亡的关系最为密切（图3A）。首先构建了包含 BID 的 3'-UTR 区的双荧光素酶报告系统，发现通过与 miR-1297 模拟物共转染后荧光素酶活性显著降低，然而在 3'-UTR 中含有突变潜在靶位点的荧光素酶活性无变化（图3B）。此外，Western blot 实验证实在 HepG2 和 SMMC-7721 细胞中抑制 miR-1297 可提高 BID 的蛋白表达水平（图3C）。

以往研究证实 BID 可通过 tBID-线粒体途径诱导细胞凋亡[14]。因此，接下来研究了 miR-1297 在肝细胞癌细胞中对相关信号通路的影响。Western blot 实验证实抑制 miR-1297 表达显著提高了线粒体中 tBID 和细胞色素 C 的表达水平（图3D）。以上结果提示，miR-1297 可通过 tBID 线粒体凋亡途径抑制肝癌细胞的凋亡。

图1 miR-1297 在肝癌组织和细胞系中上调（A：qRT-PCR 检测 109 对肝癌组织和匹配的癌旁正常组织中 miR-1297 的表达水平；B：qRT-PCR 检测 miR-1297 在永生化正常肝细胞系 QSG-7701 和肝癌细胞系 SMMC-7721 和 HepG2 中的表达水平；C：Kaplan-Meier 生存曲线分析 miR-1297 表达水平与无复发生存率之间的关系；D：Kaplan-Meier 生存曲线分析 miR-1297 表达水平与总体生存率之间的关系；**P ＜ 0.01 和 ***P ＜ 0.001） Figure 1 miR-1297 is up-regulated in HCC tissue and cell lines (A：qRT-PCR analysis of miR-1297 expression levels in 109 pairs of HCC tissues and matched nontumor tissues; B：Relative expression of miR-1297 in the immortalized normal hepatic cell line QSG-7701 and HCC cell lines SMMC-7721 and HepG2 was detected by qRT-PCR; C：Kaplan-Meier survival curves showing the relationship between high or low miR-1297 expression levels with the overall survival of HCC patients; D：Kaplan-Meier survival curves showing the relationship between high or low miR-1297 expression levels with the recurrence free survival of HCC patients;**P ＜ 0.01 and ***P ＜ 0.001)

2.5 BID 是 miR-1297 介导的抑制细胞凋亡的 原因

为了进一步阐明 BID 在 miR-1297 介导肝癌细胞凋亡中的作用，我们用 Bcl2 抑制剂 ABT-199 处理了 SMMC-7721 和 HepG2 细胞。发现在 SMMC-7721 和 HepG2 细胞中，ABT-199 对 miR-1297 的表达没有任何影响（图4A），而加入 ABT-199 后抵消了降低 miR-1297 表达对肝癌凋亡的抑制作用（图4B）。这些结果表明 miR-1297 主要通过靶向 BID 蛋白发挥其抑制凋亡的生物学功能。

3 讨论

以前的研究表明，miRNAs 在肝细胞癌的发生和发展中起着重要作用[11,15-17]，并且可以用作诊断或预后标志物。在本研究中，我们发现 miR-1297 在肝癌组织中显著上调表达，并且 miR-1297 的高表达预示着肝癌患者术后的预后不良。本研究表明 miR-1297 可能是一个潜在的预测肝细胞癌患者手术预后临床标志物和治疗的分子靶点。

图2 抑制 miR-1297 促进肝癌细胞凋亡并降低增殖能力（A：qRT-PCR 检测 miR-1297 抑制剂或对照转染至 SMMC-7721 和 HepG2 细胞后 miR-1297 的表达；B：用 CCK8 法评估 miR-1297 抑制剂或 miR-NC 转染的 SMMC-7721 细胞和 HepG2 细胞的增殖能力；C 用流式细胞仪检测 miR-1297 抑制剂或 miR-NC 转染的 SMMC-7721 细胞和 HepG2 细胞的凋亡率；*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01 和 ***P ＜ 0.001） Figure 2 Inhibition of miR-1297 promotes HCC apoptosis and reduces proliferation (A：Relative expression of miR-1297 in SMMC-7721 and HepG2 cells transfected with 80 nmol/L miR-1297 inhibitor or control; B：Estimation of cell proliferation in SMMC-7721 and HepG2 cells transfected with control or miR-1297 inhibitor by CCK8 assays; C：Rate of apoptosis of SMMC-7721 and HepG2 cells transfected with miR-1297 inhibitor or miR-NC was detected by FACS; *P ＜ 0.05,**P ＜ 0.01 and ***P ＜ 0.001)

BID 蛋白与线粒体途径诱导的细胞凋亡有关，能够有效促进细胞凋亡[18]。BID 主要分布在细胞质中，无促进细胞凋亡的活性。然而，当 caspase8 被激活时，BID 蛋白被识别并裂解成蛋白质的激活形式被称为 tBID，并且 tBID 从细胞质被转运到外线粒体膜以与 Bcl2 蛋白结合并抑制其抗凋亡作 用[14,19]或增加线粒体通透性以诱导细胞色素 C 的释放，从而激活下游 caspase3 和 caspase9 以促进细胞凋亡。最近发现，miR-20a 直接靶向 BID 基因，通过 tBID 线粒体途径诱导 TRAIL 耐药性直肠癌细胞 SW480 的凋亡。以往研究表明，HepG2 和 SMMC-7721[15-16]细胞的凋亡是由 tBID 介导的线粒体途径调控的，这与本研究的发现是一致的。本研究通过一系列实验证实发现，miR-1297 可以通过抑制 tBID-线粒体凋亡途径抑制细胞凋亡，为 BID 对细胞凋亡的调控机制研究提供了新的思路。

图3 miR-1297 直接靶向 BID[A：TargetScan 分析显示 BID 的 3'-UTR 区段存在 miR-1297 潜在结合位点，示意图显示了 miR-1297 与 BID 结合的 3'-UTR 野生型（WT）和 BID 3'-UTR 突变体（MUT）；B：过表达 miR-1297 降低了 BID 3'-UTR WT 荧光素酶活性，而未改变突变的 BID 3'-UTR MUT 中荧光素酶活性；C：Western blot 分析miR-NC 和 miR-1297 抑制剂转染的 SMMC-7721 和 HepG2 细胞中 BID 的表达；D：Western blot 分析 miR-NC 或 miR-1297 抑制剂转染的 SMMC-7721 和 HepG2 细胞系中 tBID 和 cytochrome C 蛋白表达；***P ＜ 0.001]Figure 3 miR-1297 directly targets BID [A：TargetScan analysis demonstrated the presence of putative miR-1297 targets sites in the 3'-UTR of BID.Schematic showing the putative binding sites of miR-1297 in the 3'-UTR of BID and mutations in the miR-1297 binding sites; B：Relative luciferase activity in BID 3'-UTR wild-type (WT) and BID 3'-UTR mutant (MUT) demonstrated that miR-1297 mimics downregulate luciferase activity from wild-type BID 3'-UTR,but not from mutant BID 3'-UTR; C：Western blot analysis of BID expression in SMMC-7721 and HepG2 cells transfected with miR-NC and miR-1297 inhibitor; D：Western blot analysis of the tBID-mitochondrial pathway in SMMC-7721 and HepG2 cell lines transfected with miR-NC or miR-1297 inhibitor; ***P ＜ 0.001]

图4 miR-1297 通过 BID 的转录后调控抑制 HCC 细胞凋亡（A：qRT-PCR 分析在 miR-NC 和 miR-1297 抑制剂转染的 SMMC-7721 和 HepG2 细胞后用 ABT-199 或 DMSO 处理后 miR-1297 的表达情况；B：流式细胞仪检测用 A 图处理后各组细胞的凋亡率，***P ＜ 0.001） Figure 4 miR-1297 inhibits HCC apoptosis by the post-transcriptional regulation of BID (A：qRT-PCR analysis of miR-1297 expression in SMMC-7721 and HepG2 cells transfected with miR-NC or miR-1297 inhibitor,followed by treatment with ABT-199 or DMSO,as indicated; B：Rate of apoptosis of SMMC-7721 and HepG2 cells transfected with miR-1297 inhibitor or miR-NC and treated with ABT-199 or DMSO was detected by FACS; ***P ＜ 0.001)

研究证实，miR-1297 通过靶向不同靶点在多种癌症中发挥重要作用，例如：通过靶向 cyclin D2 抑制结肠癌细胞的增殖和转移能力[17]；靶向 CREB1 抑制胃癌细胞的增殖[12]；还可靶向异黏蛋白（MTDH）抑制胰腺癌的增殖和转移[12]。MTDH也被称为星形胶质细胞上调基因-1（AEG-1）蛋白，是一种跨膜蛋白[20]。最近的研究发现，MTDH 在肝细胞癌中起着重要作用。Jung 等[21]报道，高表达的 MTDH 是肝癌患者术后总生存率和无病生存率的独立预测因子。Jyoti 等[22]的研究结果表明，MTDH 可诱导脂肪变性、抑制衰老和激活凝血途径来促进肝癌的发生和发展。Zhou 等[23]报道 MTDH 可通过诱导上皮间充质转化过程来促进肝癌转移。Li 等[24]报道敲除 MTDH 后抑制了肝癌细胞的生长并诱导其凋亡。基于 MTDH 在肝癌的发生和发展中发挥着重要作用，我们大胆猜测 miR-1297 也极有可能通过靶向 MTDH 抑制肝癌的发展，这将是我们下一步研究的重点方向。

综上所述，本研究表明，miR-1297 在肝细胞癌组织中上调表达，增强了肝细胞癌细胞的增殖能力。一系列的体外分子实验证实 miR-1297 通过靶向 BID 和抑制 tBID-线粒体凋亡途径来促进肝细胞癌的发展，表明 miR-1297 可能是一个新的肝癌治疗靶点。