冠心病患者血清微小核糖核酸-335、潜在转化生长因子结合蛋白2的表达及意义

吴英凤，王林，杨丽

(1天津海滨人民医院，天津300280；2天津市胸科医院)

冠心病病情较复杂，近年来，我国冠心病发病率呈逐年升高趋势[1]。目前，冠状动脉(冠脉)造影是国内外公认诊断冠心病的金标准，但该诊断方式会对患者造成一定程度的创伤，尤其是对于自身条件较差及对造影剂过敏患者存在一定局限性[2]。研究发现，微小RNA广泛参与细胞的凋亡、分化等过程，对肿瘤、糖尿病、感染及动脉粥样硬化等病理过程有一定的调控作用，有望成为冠心病的诊断指标之一[3]。潜在转化生长因子结合蛋白2(LTBP-2)作为细胞外基质糖蛋白之一，在机体动脉损伤、细胞黏附及弹性纤维凝聚等过程中发挥重要作用。2016年6月～2018年6月，我们观察了冠心病患者血清微小核糖核酸-335(miR-335)、LTBP-2的表达变化，并探讨二者与冠心病严重程度的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 以2016年6月～2018年6月天津海滨人民医院收治的冠心病患者102例为研究对象。纳入标准：①符合冠心病的诊断标准[4]，经冠脉造影证实至少1支血管狭窄≥50%；②患者临床资料完整，入院前未接受任何相关治疗；③年龄≥18岁。排除标准：①伴有血液、免疫系统疾病和感染性疾病者；②合并严重肝、肾功能障碍者；③有精神疾病的意识不清、无法配合本研究者。将其按照疾病类型分为稳定型心绞痛(SAP)36例(SAP组)、不稳定型心绞痛(UAP)32例(UAP组)、急性心肌梗死(AMI)34例(AMI组)。SAP组男21例、女15例，年龄32～77(58.10±5.23)岁。UAP组男20例、女12例，年龄33～75(58.02±5.18)岁。AMI组男22例、女12例，年龄38～73(57.85±5.25)岁。对照组男27例、女13例，年龄37～74(57.94±5.20)岁。参照文献[5]方法，根据Gensini总积分将冠心病患者分为轻度病变组37例(Gensini总积分在0～26.0分)、中度病变组40例(Gensini总积分在26.1～51.4分)、重度病变组25例(Gensini总积分>51.4分)。选取同期40例冠脉造影诊断为非CHD患者为对照组，排除标准同入选的冠心病患者。各组性别、年龄比较差异无统计学意义(P均>0.05)，具有可比性。本研究获得医院伦理委员会批准,各组研究对象对本研究均知情同意。

1.2 血压及血生化指标检测方法 各组研究对象入院后测量血压，采集2份清晨空腹静脉血4 mL，取其中1份，采用AU5800全自动生化分析仪(美国Beckman公司)检测空腹血糖、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平。另外1份空腹静脉血，3 000 r/min离心5 min，分离血清，采用酶联免疫吸附法检测血清LTBP-2水平，具体操作严格按照试剂盒说明书进行，相关试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。

1.3 血清miR-335、LTBP-2检测方法 各组研究对象入院后采集清晨空腹静脉血4 mL，采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测血清miR-335表达：TRIzol法提取总RNA，试剂盒购自美国Qiagen公司。以反转录试剂盒获取cDNA，具体操作严格按试剂盒说明书进行，试剂盒购自美国ABI公司。将cDNA用以qRT-PCR反应模板，并将U6作为内参基因，进行miR-355表达检测，miR-355正向引物5′-CTCCAGCTGTCAAGAGCAATAACGAA-3′，反向引物5′-TCCAGTCCCTCCGAGGT-3′；U6正向引物5′-ATTGGAACGATACAGAAGATT-3′，反向引物5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。其中qRT-PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司，qRT-PCR反应体系： cDNA 1.0 μL，SYB Preimix Ex TaqTM10 μL， Primer 0.8 μL， RNase H2O 12.4 μL。qRT-PCR反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，40个循环。通过2-△△Ct法计算miR-335表达。

2 结果

2.1 四组血压及血生化指标水平比较 对照组、SAP组、UAP组、AMI组收缩压、舒张压、空腹血糖、TG、TC、LDL-C、HDL-C水平比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，见表1。

表1 四组血压及血生化指标水平比较

2.2 四组血清miR-335、LTBP-2水平比较 对照组、SAP组、UAP组、AMI组血清miR-335水平呈逐渐下降趋势，而血清LTBP-2水平呈逐渐升高趋势，单因素方差分析结果显示，各组间差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表2。

表2 四组血清miR-335、LTBP-2水平比较

注：与对照组相比，#P<0.05；与SAP组相比，*P<0.05；与UAP组相比，△P<0.05。

2.3 不同病变程度冠心病患者血清miR-335、LTBP-2水平比较 轻度病变组、中度病变组、重度病变组血清miR-335水平呈逐渐下降趋势，而血清LTBP-2水平呈逐渐升高趋势，单因素方差分析结果显示，各组间差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表3。

表3 不同病变程度冠心病患者血清miR-335、LTBP-2水平比较

注：与轻度病变组相比，#P<0.05；与中度病变组相比，*P<0.05。

2.4 冠心病患者病情严重程度与血清miR-335、LTBP-2的相关性 冠心病患者病变严重程度与血清miR-335水平呈负相关(r=-0.673，P<0.05)，而与LTBP-2水平呈正相关(r=0.705，P<0.05)。

3 讨论

冠心病属于临床常见的心血管疾病之一，已成为全球范围内严重危害人类生命健康安全的重大疾病。如不采取及时有效的治疗，随着病情的进展会导致UAP及AMI的发生，增加患者的死亡风险[6]。因此，早期正确对冠心病患者进行诊断，并对其病情进展进行有效监测，是降低患者潜在血管事件发生及改善预后的重要途径[7]。miRNAs作为一种可特异性结合靶向mRNA的短序列非编码RNA，参与了细胞增殖、分化、凋亡及肿瘤形成等生物学过程[8]。miR-335主要定位于人类染色体7q32.2上，已被证实参与人类胃癌、乳腺癌等多种肿瘤的发生发展。LTBP-2是近年来新发现的细胞外分泌蛋白，广泛存在于人体心脏、肝脏以及肺脏中，其功能接近于原纤蛋白。LTBP-2参与多种疾病的发生发展[9]。研究表明，LTBP-2可通过调控转化生长因子的活性起到稳定细胞外基质的作用。研究发现，LTBP-2在心肌纤维化中起重要作用[10，11]。然而，关于miR-335与LTBP-2在心血管疾病中的研究报道并不多见。

本研究结果表明，各组基线资料无统计学差异，排除其他因素对本研究结果的干扰，为后面的研究奠定可信度。而对照组、SAP组、UAP组、AMI组血清miR-335水平呈逐渐下降趋势，而血清LTBP-2水平呈逐渐升高趋势，且经单因素方差分析发现，各组间差异均有统计学意义。说明冠心病患者血清miR-335存在明显低表达，而LTBP-2水平存在明显高表达，提示上述两项指标可能成为评估冠心病患者病情严重程度的有效指标[12]。另外，轻度病变组、中度病变组、重度病变组患者血清miR-335水平呈逐渐下降趋势，而血清LTBP-2水平呈逐渐升高趋势，提示随着冠心病患者病情逐渐恶化，miR-335表达越低，而LTBP-2越高，临床通过对上述两项指标水平进行检测，有助于判断冠心病患者的病情严重程度。有研究表明，miR-335可负向调控钙调蛋白，参与急性缺血性脑卒中的发生发展[13]。Lee等[14]通过探讨miR-335对大鼠模型微血管内皮细胞凋亡的影响发现，miR-335可能在缺氧复氧过程中发挥关键调控作用，推测其可能成为缺血再灌注损伤的治疗新靶点。笔者推测，miR-335可能通过与动脉粥样硬化病变基因mRNA 3′端非编码区结合，起到非特异性降解mRNA的作用，进而阻止冠状动脉粥样硬化病变的发生[15]。转化生长因子β1(TGF-β1)由巨噬细胞分泌，在冠状动脉粥样硬化发生发展中起重要作用[16]。白媛媛等[17,18]研究发现，TGF-β1可通过ERK和PI3K信号通路促进心肌细胞中LTBP-2表达，后续纳入133例呼吸困难患者进一步研究发现，LTBP-2对心力衰竭的诊断价值与N-末端脑钠肽前体相当，有望成为临床心血管疾病早期及预后的生物标志物，但其具体机制有待进一步研究证实。上述研究结果均为miR-335与LTBP-2成为冠心病的诊断指标提供了可能性。进一步经Pearson相关性分析发现，冠心病患者病变严重程度与血清miR-335水平呈负相关关系，而与LTBP-2水平呈正相关关系。提示血清miR-335、LTBP-2水平与冠心病患者病情严重程度相关，可随着病情的变化而变化。临床可通过联合检查miR-335与LTBP-2水平，从而有效反映冠心病患者的病情变化，进一步为临床治疗方案的制定提供参考依据，达到改善患者预后的目的。

综上所述，冠心病患者血清miR-335水平降低，而LTBP-2水平升高;二者联合检测有助于患者病情程度的评估。