微球法观察急性低氧应激对小鼠脏器血流量的影响※

袁周阳，张 昱，马倩倩，周义玲，汪晓洲，纪巧荣，曹成珠，刘 杰，穆罕默德·杰马，张 伟，2，3*

(1.青海大学医学院；2.青海大学高原医学研究中心；3.青海省高原医学应用基础重点实验室，西宁 810001)

无论是急进高原的人群还是航空、航天作业中突发急性缺氧的人群，急性低氧应激的代偿都对机体适应突变的外界环境起着非常重要的调节作用，主要影响心血管系统及呼吸系统。目前低氧应激早期循环系统血流分布情况不明，其对深入研究高原病的发生发展和航空、航天医学研究造成了障碍。本研究主要通过给予小鼠急性低氧通气模拟急性低氧应激刺激，采用彩色微球技术来观察刺激状态下小鼠主要脏器的血流分布情况。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

实验选用BALB/c雄鼠，购于北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证号为：SCXK(京)2016-0006号]，分对照组和低氧组，每组8只，体重26±2 g。小鼠均置于24 ℃、昼夜交替、自由饮食饮水条件下饲养。

1.2 实验药品和试剂选择

彩色微球(黄色，红色，蓝色)DYE-TRAK购于Triton Technology 公司；Tween80和Triton X-100购于Solarbio公司，硫柳汞购于上海中秦化学试剂有限公司，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)购于Aladdin公司，无水乙醇购于天津市富宇精细化工有限公司，戊巴比妥钠购于上海泰瑞尔生物技术有限公司。

1.3 实验仪器选择

Power Lab生物信号采集系统、压力传感器购于AD Instruments公司，呼吸机(950 North Hague Avenue Columbus，Ohio 43204-2121 U.S.A)购于Columbus Instruments公司，酶标仪(infinite M200 PRO)购于TECAN公司，手持式血液分析仪(300-G)购于雅培贸易上海有限公司。

1.4 实验动物手术

小鼠于术前12 h禁食，用1%戊巴比妥钠行腹腔麻醉后固定于小鼠体温维持操作板，做小鼠气管插管及右颈总动脉插管，将聚乙烯导管(ID 0.3mm，OD 0.5mm)经右颈总动脉置入左心室。通过Power Lab生物信号采集系统监测小鼠左心室压，判定导管已到达心室腔。将小鼠气管插管连接呼吸机，设置潮气量为6.5 mL/kg。对照组小鼠通入室内空气(西宁地区，大气压582mmHg，PO2121.6mmHg)，低氧组通入15%氧气浓度的混合气体(15% O2，85% N2)。两组于通气1、3 min末通过左心室插管向心室匀速注入黄色、红色微球制备液100 μL(微球数约60000个)后，立即用适量肝素生理盐水冲管，待微球稳定5 min，腹腔注射过量麻醉药品处死小鼠。

1.5 脏器组织处理

取小鼠心、脑、肺、肝脏和肾脏组织，用半干滤纸吸净脏器组织上的多余血液，置于15 mL离心管称量。组织处理方法参照Hakkinen[1]和粱斌[2]等的方法。首先向各组织样本中加入100 μL含5 000个蓝色微球的微球质控液，作为回收率测定的质控物。向各个离心管中加入12 mL浓度为1 mol/L的KOH溶液，混匀后放置于60 ℃水浴锅过夜(12h)。期间需开盖释压、涡旋，待组织器官完全消化溶解后，离心(1500g)15 min后用吸管抽弃上清液至距管底1 cm高度，勿扰动管底微球。加入50 ℃蒸馏水12 mL，混匀后离心(1500g)5 min，弃上清液至管底1 cm处。再加入10% TritonX-100试剂12 mL，离心(1500g)5 min后弃上清液(脑组织处理需使用15% TritonX-100试剂12mL，重复两次)。最后每管先后加入酸化乙醇和无水乙醇12 mL，离心(1500g)5 min后弃上清液，打开离心管盖存放在避光处，至无水乙醇于室温下完全蒸发。单独制备6个蓝色微球的100%回收标准管，每管加入相应含5 000个蓝色微球的质控液100 μL，加入无水乙醇6 mL，离心(1500g)5 min后抽弃上清液，避光开盖待干燥后测其标准管蓝色微球吸光度值，作为标准管的OD值。

向已干燥的离心管中加入DMF试剂150 μL，静置15 min后涡旋15 min，待微球染料充分被萃取。离心(1500g)5 min后小心取出离心管。用移液枪吸取100 μL提取液到96孔板中。设置波长：黄光448 nm、红光535 nm、蓝光672 nm。分别检测组织样本提取液在不同最大吸收波长处的吸光度值，根据公式计算组织脏器相对血流量。

1.6 动脉血气分析

另取小鼠建立气管插管通道，采用右侧颈总动脉插管法在低氧通气前、低氧通气1 min、低氧通气3 min时取动脉血约90 μL行动脉血气分析。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 微球回收率情况

图1显示，标准管和各组织样本回收微球吸光度情况，蓝色微球标准管(STDS)平均吸光度值为0.2330(标准差0.007)AU(作为100%回收率)。实验所测得组织样本微球回收率在84.86%到92.05%之间，符合实验要求。

图1 各组织脏器蓝色质控微球染料回收吸光度结果图Figure 1 Mean absorbance of dye extracted from blue microspheres isolated from tissues of mice

2.2 小鼠器官相对组织血流量结果

表1显示，通气3 min和1 min时相比，各个器官组织血流量有所降低(除低氧组肺营养血管血流量外)，但与对照组相比，低氧1 min和3 min的相对血流量趋势大致相同。

血流测量结果显示，急性低氧应激时脑血流量明显增加(P<0.05)、心肌组织血流量有所升高但无显著差异(P>0.05)、肺营养血管血流量有所升高但无显著差异(P>0.05)、肝组织血流量明显降低(P<0.05)、肾组织血流量升高(P<0.05)。

表1 小鼠器官相对血流量结果Table 1 The resul to frelative blood flow in

续表：

2.3 通气1 min到3 min小鼠器官组织血流量降低结果

表2显示，通气3 min和1 min时相比，在脑血流降低量(0.0130±0.0066，0.0138±0.0038，P>0.05)、心肌血流降低量(0.0458±0.0822，0.0456±0.0400，P>0.05)、肝脏血流降低量(0.0031±0.0025，0.0020±0.0011，P>0.05)以及肾血流降低量(0.0914±0.0552，0.0894±0.0450，P>0.05)上，对照组和低氧组均无显著差异，肺营养血管血流降低量(0.0073±0.0052，0.0006±0.0025，P<0.05)在低氧组明显低于对照组。

表2 通气1min到3min小鼠器官组织血流降低情况Table 2 The changes of blood flow from 1 min to 3min

2.4 常氧通气、低氧通气1 min、低氧通气3 min时的动脉血气分析结果

表3显示，常氧与低氧通气1、3 min时采集动脉血行血气分析对比，结果显示与常氧时比较，低氧通气1、3 min时小鼠动脉血pH值无明显差异，动脉血氧分压(Arterial partial pressure ofoxygen，PaO2)和血氧饱和度(Arterial Oxygen Saturation，SaO2)均降低(P<0.05)；低氧通气1 min与3 min时比较，血气分析结果无统计学差异。

表3 常氧通气、低氧通气1 min、低氧通气3 min时动脉血气分析结果Table 3 The results of arterial blood gas under normoxia and hypoxia 1 min and 3

* ：P<0.05，与Normoxia比较；#：P<0.05，与Hypoxia 1 min比较

3 讨论

应激(stress)作为重要的非特异性防御反应，是机体在受到内外环境的刺激时出现的一种各系统调节动员的反应[3]。发生应激反应时，下丘脑-垂体-肾上腺皮质系统(hypothalamus-pituitary-adrenal cortex system，HPA)和交感-肾上腺髓质系统(sympathetic cadrenal medulla system)被激活，对机体有重要的调节作用[4]。本研究采用在海拔2 260米、大气压582 mmHg、氧分压87.3 mmHg下的西宁地区向实验小鼠通入15% O2和85% N2的混合气体(相当于海平面11%的O2含量)开展相关实验，其中氧气浓度是课题组前期研究的有效低氧应激氧气浓度[5]。对照组及低氧组均采用气管插管连接呼吸机通气，保证通气的频率及深度，排除了由于缺氧引起过度通气导致CO2分压改变对血流量的影响[6]。实验通过呼吸机给小鼠通入室内空气和低氧气体并选取颈外动脉采集动脉血[7]行血气分析结果对比，达到了研究急性低氧应激小鼠实验目的。

测量血流量的方法很多，常用的方法有超声多普勒测血流法、激光多普勒血流检测法、二氧化碳费克法、彩色微球测血流法等[8，9]。本实验采用彩色微球法可以测量多个组织脏器在同一时刻的血流量。彩色微球是一种直径为15 μm的聚苯乙烯小球，从实验动物左心室注入微球混悬液，微球随体循环血液被运送至各个组织脏器并嵌顿于其毛细血管中，通过脏器组织处理，回收微球并萃取其表面染料，再通过紫外分光光度计或酶标仪来检测微球染料在不同最大吸收波长处的OD值，根据公式计算组织脏器相对血流量，所测OD值与实验动物脏器相对血流量呈正比关系。彩色微球法不仅可一次性测量同一时刻多个脏器的血流量，还可序贯测定同一实验动物经历多种条件时的脏器血流变化，且彩色微球与放射微球相比具有无辐射、易储存等特点，是国内外广泛认可的一种测血流量的经典方法[10]。

研究发现，急性低氧通气时，脑、肾血流显著升高，心肌血流量有所升高，肝血流量明显下降。在注入微球1 min至3 min血流量变化结果中，3 min血流量较1 min普遍降低，但各组变化趋势大致相同。我们推测是由于1 min时注入的微球在脏器组织造成了一定程度的嵌顿，导致3 min血流量整体下降；但低氧应激时的肺营养血管血流在1 min至3 min时降低不明显，与对照组相比，1 min至3 min的血流降低量明显小于对照组，提示低氧应激时肺营养血管的血流量反而增加。

由于实验通过呼吸机给予实验动物低氧通气，因此可排除低氧通气反应、低碳酸血症血管收缩反应等因素造成的血流变化，低氧血管舒张反应可能是引起脑、肾血流升高的原因。有研究表明低氧能扩张人类大脑中动脉、颈动脉以及椎动脉[11]。缺氧时，脑血流的补偿性增加足以维持脑氧输送。低氧对脑血流影响的潜在机制较复杂，涉及诸多生理学因素，存在代谢和生化过程的相互作用。脑血管扩张的机制可能会和低氧暴露程度、持续时间，大脑对O2、CO2和pH变化的反应性以及局部释放血管活性因子的程度有关[12，13]。有关肾脏在急性低氧时血流量的变化研究较少，主要为新生儿窒息与肾血流相关性的研究，结果表明窒息缺氧时新生儿肾血流灌注阻力增大、流速减慢导致肾血流灌注减少[14]。因其选用的研究对象为出生大于24 h的窒息儿，与本研究选用的急性低氧通气3 min小鼠无论从研究对象还是缺氧情况都具有巨大差异。非神经系统器官肝脏在低氧应激时血流量下降，可能与肝血管中分布的介导血管收缩受体及受体密度不同导致低氧应激时肝脏血流降低有关。肺组织所测血流量为微球嵌顿在肺营养血管中所测得血流情况，各脏器组织3 min较1 min血流量均降低但低氧应激时的肺营养血管血流1 min到3 min无明显变化，推测低氧应激可调节肺营养血管使血流增加，保证在急性低氧应激时肺组织的血氧供给量[5，15]。

综上所述，急性低氧应激作为一种外界刺激因素能够影响小鼠脏器组织血流分布，使脑、肾和肺营养血管血流升高，肝血流降低。这种变化可能与低氧应激时组织脏器血流重新分布，优先供应重要脏器有关。