藏药五味沉香散对低氧大鼠海马神经细胞损伤的保护作用*

严云飞，靳国恩，曹成珠，李晓娜，米国霞， 李生花

(青海大学医学院，西宁 810001)

在实际应用中发现，五味沉香散(沉香、黄芪、川芎、酸枣仁、甘草)具有抗缺氧作用，但无理论依据。本研究通过相关实验设计，明确其相关作用及可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

SPF级雄性SD大鼠购自西安交通大学医学实验动物中心[SCXK(陕)2017-003]。随机分为低氧组(生理盐水组，NS)、阳性对照组(红景天组，HJT)、低氧药物组(五味沉香散组，WW)，每组10只，均置低压氧舱(模拟海拔5500m的低氧环境)中，30 d后取出脑组织，通过免疫组化和酶联免疫吸附实验法行HIF-1α、Beclin-1、Bcl-2水平测定，同时制作脑组织形态学切片。

1.1.2 主要仪器、试剂

低压氧舱购自中航风雷公司；电泳仪、电泳槽、ECL发光液购自Bio-Rad公司；RIPA、PMSF、4%多聚甲醛(815B0215)、2.5%电镜固定液(P1126)均购自索莱宝公司；蛋白酶抑制剂购自罗氏公司；BCA蛋白定量试剂盒、酶联免疫吸附实验试剂盒(E-EL-R0513c)购自武汉伊莱瑞特生物公司；PVDF膜购自Mil-Lipore公司；HIF-1α(ab179483)购自abcam公司；Beclin- 1 Antibody(ab6721)、Bcl-2(ab6940)购自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 酶联免疫吸附实验方法

将标准品工作液依次加入两列孔中，每个浓度的工作液并列加两孔，每孔100 μL。待测样品加入到其他孔，每孔100 μL(若样本浓度高于检测范围，需用标准品、样本稀释液稀释后取样)。酶标板覆膜：于每个孔中加入生物素化抗体工作液100 μL混匀，酶标板加上覆膜，孵育(37℃)90 min。甩尽孔内液体，每孔加洗涤液350 μL，浸泡1～2 min，吸去或甩掉酶标板内的液体，在厚的吸水纸上拍干，重复此洗板步骤3次。每孔加酶结合物工作液100 μL，覆膜，温育(37℃)30 min。弃去孔内液体，甩干，洗板5次。每孔加90 μL底物溶液(TMB)，覆膜，避光孵育(37℃)15 min左右。加终止液(50μL)终止反应即刻用酶标仪在450 nm波长处测量各孔的光密度(OD值)。

1.2.2 免疫组化方法

1.2.3 统计学方法

实验数据采用SPSS 16.0软件进行统计学分析，进行方差分析，三组间两两比较采用q检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 慢性低氧对三组大鼠脑组织Bcl-2、HIF-1α、Beclin-1水平的影响

慢性低氧对三组大鼠脑组织Bcl-2、HIF-1α、Beclin-1水平的影响结果见表1。

表1 低氧30天三组大鼠脑组织Bcl-2、HIF-1α、Beclin-1 水平(OD值)Table 1 Brain tissue Bcl-2，HIF-1α and Beclin-1 levels of three groups of rats at 30 days of

* ：与NS比较，P<0.05

表1显示，五味沉香散组Bcl-2水平显著高于生理盐水组(P<0.05)。五味沉香散组HIF-1α水平显著低于生理盐水组(P<0.05)。五味沉香散组Beclin-1水平显著低于生理盐水组(P<0.05)。提示在低氧环境中五味沉香散可降低大鼠脑组织HIF-1α、Beclin-1的表达，同时可增高Bcl-2的表达，即可增加抗凋亡基因的表达，降低促凋亡因子及低氧诱导因子的表达，起到抗凋亡、缺氧的作用。

2.2 慢性低氧对三组大鼠脑组织形态学的影响

图1 低氧30天三组大鼠脑组织切片图(×40)Figure 1 Slides of brain tissue in three groups of rats at 30 days of hypoxia(×40)

图1显示：

Beclin-1在生理盐水组细胞数量最多，细胞排列最乱；在红景天组细胞数量稍有下降，细胞排列稍整齐；在五味沉香散组细胞数量最少，细胞排列最为整齐。

Bcl-2在生理盐水组细胞数量最少，细胞排列紊乱；在红景天组细胞数量稍有增多，细胞排列紊乱；在五味沉香散组细胞数量最多，细胞排列整齐。

HIF-1α在生理盐水组细胞数量最多，细胞排列最乱；在红景天组细胞数量稍有下降，细胞排列紊乱；在五味沉香散组细胞数量最少，细胞排列整齐。

3 讨论

本研究探讨五味沉香散对慢性低氧大鼠海马神经细胞损伤的保护作用，通过五味沉香散对HIF-1α活性及大脑海马组织中Beclin-1、Bcl-2表达的影响，确认其功效并初步考察作用机制。

内环境氧浓度的平衡是机体进行正常有氧代谢的必要条件，当暴露于低氧环境中，机体会立即产生应激和耐氧适应性反应，如心率加快、头晕乏力、昏厥甚至窒息死亡等。HIF-1作为高度特异性的核转录因子，在细胞感知和适应内环境氧分压变化的过程中，发挥着重要的作用[1]。它是一种异源二聚体，主要由120 kD的HIF-1α和91～94 kD的HIF-1β两个亚单位组成，在低氧环境中，HIF-1的表达明显增多。Bcl-2是一种抑制凋亡的线粒体内膜蛋白，具有抗细胞凋亡的功能[2]，基因及其表达蛋白可抑制多种细胞的凋亡，所以称其为凋亡抑制基因。Bcl-2在正常的套区和边缘带中小B淋巴细胞和一些T细胞中有表达， 其表达和调控是影响细胞凋亡的关键因素之一；它能够阻止细胞色素C从线粒体释放到细胞质，参与细胞凋亡的调控，抑制细胞凋亡。Bcl-2抗细胞凋亡的作用机制可能与抑制内质网管内钙离子释放有关[3]。Beclin-1基因也称BECN1基因，是一种自噬相关基因，在自噬中发挥重要作用[4]，Beclin-1基因是参与自噬调控的重要因子，已证实在多种肿瘤组织及低氧组织中呈低水平表达[5]，它与Bcl-2基因相互拮抗调控自噬。

本研究将大鼠置于海拔5 500 m的模拟低氧环境中，分别用生理盐水、五味沉香散及红景天灌胃发现：暴露低氧30 d，五味沉香散组和红景天组的HIF-1α及Beclin-1的水平均明显低于生理盐水组，与生理盐水组相比具有显著性差异；而五味沉香散组和红景天组Bcl-2的水平明显高于生理盐水组，与生理盐水组相比具有显著性差异。说明在低氧条件下，五味沉香散可以降低Beclin-1及HIF-1α的表达，促凋亡基因Beclin-1表达减少，提示此药物对细胞有保护、修复的作用；HIF -1α表达降低，提示此药物具有抗缺氧的作用；Bcl-2表达增高，提示此药物可以抑制神经元凋亡对脑细胞起保护作用。

综上所述，五味沉香散对慢性低氧大鼠海马神经细胞损伤有修复和保护作用。