慢性高原病患者发生血栓与血浆EMP和P-选择素水平的关系※

王卓亚，杨发满，汪雪萍，旦增诺扬

(1.青海大学附属医院，青海 西宁 810001；2.青海大学高原医学研究中心，青海 西宁 810001)

大量研究表明慢性高原病(Chronic Mountain Sickness，CMS )患者凝血功能异常，发生血栓和出血的风险均升高[1-3]。慢性高原病出血风险增高与凝血因子减少和血小板减少有关，慢性高原病血栓形成与什么有关目前了解有限。本研究旨在了解EMP和P-选择素与慢性高原病患者发生血栓的关系。

内皮细胞微粒(Endothelial Microparticles，EMPs)是内皮细胞在激活或凋亡状态下所释放的微小、不含细胞核的囊泡状物质，大量研究证实EMPs可以反映内皮细胞的损伤状况[4-5]，CMS患者由于缺氧，可使血管内皮广泛受损，从而可能促进炎症因子的释放致凝血系统激活，促进血栓形成。P-选择素(P-selectin)是PLT活化时释放于血浆中介导活化PLT和内皮细胞、白细胞和内皮细胞之间的黏附作用，是PLT活化释放的特异标志物，其水平升高与血栓的发生密切相关[6]。本研究拟通过相关方法明确慢性高原病患者发生血栓与血浆EMP、P-选择素水平之间的关系。

1 资料与方法

1.1 样本选择

选取2016年12月～2018年9月入住青海大学附属医院的慢性高原病合并深静脉血栓患者20例入CMS+T组(年龄46.00±8.60岁，海拔3216.5±332.8米)、慢性高原病患者40例入CMS组(年龄45.63±9.34，海拔3387.5±413.1米)；选取同期就诊我院的世居高原健康体检者(海拔2500米及以上)40例入高原control组(年龄43.83±11.12岁，海拔3228.5±314.6米)。以上受试者均为汉族、男性，各组间年龄、居住海拔无统计学差异(P>0.05)。慢性高原病标准符合2004年慢性高原病青海标准[7]。对慢性高原病组有深静脉血栓症状的患者，完善下肢静脉CTV和肺动脉CTA检查以确诊深静脉血栓排除肺栓塞。CMS患者排除真性红细胞增多症、骨髓增殖性疾病及由于肺部疾患及睡眠障碍导致的继发性红细胞增多症。所有受检者近3月均未使用影响凝血功能及血小板功能药物。本研究经青海大学附属医院伦理委员会审查同意，所有患者及志愿者均已签署书面同意书。

1.2 血常规及凝血指标测定

所有受检者抽取空腹静脉血2 mL于EDTA管中，应用全自动血细胞分析仪(SYSMEXXE-2100)测定血常规；高原对照组抽取2 mL静脉血，CMS患者抽取3.6 mL于柠檬酸钠管中用全自动凝血功能仪(SYSMEX-CA7000)测定凝血功能。

1.3 EMPs水平测定

所有受检者在治疗前抽取空腹静脉血5 mL于EP管中，离心(160g，20min)获取富血小板血浆，吸取上层(2/3)血浆离心(1000g，20min)获取乏血小板血浆。将特异性荧光标记抗体(anti-CD31-PE，anti-CD42-FITC)0.5 μg或等量的同型对照抗体加入到50 μL的乏血小板血浆中，室温孵育30 min，随后加入1 mL PBS液后采用流式细胞仪(美国BD公司-FACSCantoII )检测，标本上机前用0.1～1.0 μm的标准进行前项角设门，门内收集的微粒进行FITC和PE荧光强度分析。EMPs定义为直径0.1～1.0 μm且CD31+/42b-的微粒。

1.4 P-选择素测定

所有受检者未治疗前抽取肘静脉血5 mL，离心(1000g，10min)取血浆于EP管中，用P-选择素试剂盒(上海远慕)测定标本血浆含量。

1.5 统计学处理

采用SPSS17.0软件包进行数据处理。计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验，两个变量之间的关系采用Pearson直线相关分析，危险因素采用Logistic回归，检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 三组间的血红蛋白、血小板和凝血功能与EMPs、P-选择素水平比较

CMS+T组及CMS组血红蛋白明显高于control组，差异有统计学意义(P<0.05)；CMS+T组及CMS组之间血红蛋白水平无统计学差异(P>0.05)。血浆EMPs、P-选择素水平在高原对照组和CMS、CMS+T组均依次升高，各组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，结果见图1-1～3；CMS+T 组D-二聚体水平高于CMS组和Control组，差异有统计学意义(P<0.05)；③CMS组和CMS+T组PT、APTT长于Control组(P<0.05)，CMS组和CMS+T组PLT低于Control组(P<0.05)，慢性高原病合并血栓组与CMS组之间无统计学差异(P>0.05)(表1)。

表1 各组之间EMPs、P-选择素、Hb、PLT和凝血指标的比较Table 1 Comparison of EMPs，P-selectin，PLT and coagulation indicators among three

* ：与CMS组比较，P<0.05；△：与对照组比较，P<0.05

1-1 CMS+T组EMPs水平1-2 CMS组EMPs水平1-3 control组EMPs水平

上述结果提示慢性高原病患者无论是否合并血栓与高原健康组比较，其血小板减少，PT、APTT延长，提示慢性高原病患者存在凝血功能异常，具有出血倾向；同时EMPs、P-选择素、D-二聚体升高，提示存在血栓发生的风险，即慢性高原病患者存在出血和血栓的双重风险。D-二聚体在血栓组明显升高，与其他两组差异有统计学意义，支持D-二聚体是血栓形成的评估指标，但其是血栓形成后的结果，我们此次研究的目的是确定对血栓的形成的可能影响因素。

2.2 CMS患者发生血栓的危险因素分析

分析慢性高原病组和慢性高原病合并血栓组患者的临床资料，EMPs、P-选择素、Hb的升高可能是血栓的形成原因，PLT减少、PT和APTT延长可能是血栓形成的抑制因素，故将CMS是否发生深静脉血栓作为因变量，将EMPs、Hb、PLT、PT、APTT 和P-选择素作为自变量，并进行赋值(表2)做Logistic回归分析。结果显示，血浆EMPs水平是慢性高原病血栓发生的独立危险因素，OR=9.947，P=0.005，PT是慢性高原病预防血栓发生的保护性因素，OR=0.134，P=0.017(表3)。提示慢性高原病患者随着血浆EMPs水平升高，发生血栓的风险度升高，随着PT的延长，发生血栓的风险度降低。临床上可以通过检测血浆EMPs、PT来判定该患者发生血栓的风险度。

表2 CMS指标变量数量化及赋值表Table 2 Quantification for variables of chronic mountain sickness

表3 CMS患者发生血栓的危险因素Table 3 Risk factors for thrombosis in CMS patients

2.3 EMPs、P-选择素与凝血指标的相关性分析

CMS+T组EMPs水平与P-选择素呈中度正相关，EMPs与D-二聚体呈中度正相关，P-选择素与凝血指标无关，见图2～3。

图2 EMPs和P-选择素关系的散点图Figure 2 Scatter plot of the relationship between EMPs and P-selectin

图3 EMPs与D-二聚体的散点图

3 讨论

血栓形成的原因有心血管内皮系统的受损、血流的紊乱、血液成分的改变等。CMS患者一方面因慢性缺氧刺激导致红细胞代偿性增加，使血液具有“浓、黏、聚、凝”的特点[8]，血流紊乱易发生血栓栓塞性疾病；另一方面，高原低氧可导致血管内皮细胞发生损伤，从而导致内皮细胞功能紊乱[9]，激活机体内、外源性的凝血途径，使血液呈高凝状态。因此寻找CMS发生血栓的危险因素，提前给予干预治疗，对改善CMS 的凝血功能状态具有重要的临床意义。

本研究发现，EMPs和P-选择素在高原健康对照组、慢性高原病组、慢性高原病合并血栓组依次升高。血浆中EMPs水平是新近发现的一种评估内皮功能损伤的方法[10]，慢性高原病患者由于长期缺氧导致广泛内皮系统受损[9]，表现为血管内皮屏障作用减弱，信息传递及分泌能力下降，扩血管物质自分泌能力下降，缩血管物质相对增加，白细胞黏附及血小板聚集度增强，抗凝血功能出现障碍，抗血栓作用下降，出现血液的高凝状态[11]。本研究中慢性高原病合并血栓患者EMPs 水平最高，提示内皮系统受损最为严重，推测其继而可引起局部血管收缩、白细胞黏附、炎症反应增重、血小板聚集增强，出现局部血栓。慢性高原病组患者虽然没有影像学提示的静脉血栓，但由于低氧、血流淤滞缓慢，对内皮系统仍有一定程度的损伤，所以EMPs在三组间递减。Logistic回归结果提示，EMPs是慢性高原病发生血栓的独立危险因素，相关性研究提示：EMPs与D-二聚体水平存在一定的相关性，故在慢性高原病组患者行血浆EMPs检查对于判断该类患者发生血栓的风险度有一定的指导意义。

P-选择素属于选择素家族的一种，主要存在于内皮细胞的棒管状小体内或者血小板α颗粒中。血清中的可溶性 P-选择素分子是在内皮细胞损伤或血小板活化时释放到血液中形成的，可作为机体内血栓形成的诊断靶标[12]。血浆中P-选择素基础水平较低主要来源于血小板，而在疾病状态下高水平的P-选择素水平则主要由活化的内皮细胞分泌[13]和活化的血小板释放，使得血清可溶性 P-选择素表达水平明显升高，进而介导血小板或血管内皮细胞与中性粒细胞、单核细胞的相互黏附作用，最终促进血管内血栓的形成[14，15]，使机体处于高凝状态。在本研究中慢性高原病合并血栓组P-选择素水平最高，慢性高原病组次之，高原对照组最低，与EMPs在三组间的水平趋势一致，我们进行了EMPs与P-选择素的相关性分析，发现两者之间存在显著的中等程度的正相关，也进一步支持了疾病状态下高水平的P-选择素水平主要由活化的内皮细胞分泌和内皮受损引起血小板活化所致。同时提示在慢性高原病发生血栓的风险度增高。

此次研究中发现慢性高原病患者和合并血栓患者血小板减少，分析原因可能与以下因素有关：①长期缺氧会使巨核细胞成熟障碍，使巨核细胞数目下降[16]，同时红细胞和血小板的前体细胞存在着竞争关系，慢性高原病患者红细胞增多，红系祖细胞增殖抑制了巨核系的增殖[17]。②慢性高原病患者血小板活化增多，导致消耗增多[18]。在分析CMS患者形成血栓的危险因素时发现，血小板水平降低并不是预防血栓发生的保护性因素，可能与部分血小板减少使其活化、消耗过多有关，而血小板活化是会增加血栓风险的。

同时我们还发现慢性高原病组及慢性高原病合并血栓组PT、APTT延长。据本课题组先前研究发现：慢性高原病患者FⅡ、FⅤ、FⅦ、FⅨ、FⅩ水平降低，提示慢性高原病患者内源性和外源性凝血功能障碍与凝血因子的减少有关。故慢性高原病患者和同时合并血栓的患者出血风险度增高，分析慢性高原病患者发生血栓的危险因素发现，PT是血栓发生的保护因素，PT越长，提示发生血栓的风险度越低，可据此指标结合其他指标来判断血栓及出血发生的风险程度。

综上所述，慢性高原病患者合并血栓患者血浆EMPs、TF-MPs水平升高，血浆EMPs水平与D-二聚体有一定的相关性。临床上我们通过动态监测PT、APTT可以判断出血风险度，同时我们可以结合血浆EMPs、PT来判断发生血栓的危险程度。