豇豆轻斑驳病毒海南分离物全基因组序列测定及分子特征

杨 晓 张 宇 陈 莎 刘 勇， 张德咏，* 李桑桑 龚一诺 张 卓 鲁清华 胡 荣

（1湖南大学研究生院隆平分院，湖南长沙 410125；2湖南省农业科学院植物保护研究所，湖南长沙410125）

豇豆轻斑驳病毒（Cowpea mild mottle virus，CpMMV）属乙型线形病毒科（Betaflexiviridae）香石竹潜病毒属（Carlavirus），基因组为正单链 RNA，长度为8.3～8.7 kbp， 具 有 5′ 帽子和3′Poly（A）尾；编码6个ORFs， 分别为RNA依赖的RNA聚合酶（RNA dependent RNA polymerase，RdRp）、三重基因块 1（triple gene block1，TGB1）、三重基因块 2（triple gene block 2，TGB2）、三重基因块 3（triple gene block 3，TGB3）、外壳蛋白（coat protein，CP）和核酸结合蛋白（nucleic acid binding protein，NB）（Menzel et al.，2010）。

1973年首次发现CpMMV侵染非洲加纳的豇豆（Brunt & Kenten，1973），随后在亚洲、中东以及美洲均发现该病毒的侵染（Jeyanandarajah & Brunt，1993；Almeida et al.，2005；Zinsou et al.，2015）。CpMMV可由烟粉虱传播，亦可种传，其传播速度快，主要侵染豆科（Leguminosae）、茄科（Solanaceae）、苋科（Amaranthaceae）和葫芦科（Cucurbitaceae）等多种植物。主要发病症状为叶片轻斑驳，部分作物上还会产生叶片畸形和褪绿、甚至坏死等症状（Almeida et al.，2005）。

在前期病害调查中，发现CpMMV侵染海南的豆科植物，发病症状主要为叶片轻斑驳、部分植株矮化；发病株率为30%～85%，严重影响海南豆科植物的安全生产。因此，本试验以从海南采集的感染CpMMV的豇豆病叶为材料，采用RT-PCR及常规测序，得到了CpMMV海南分离物的全基因组序列，并进行系统发育分析和重组分析，为该病毒的流行分析和致病性研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

疑似感染CpMMV的豇豆叶片，2016年1月采集于海南省澄迈县，共采集病叶5份，感病叶片症状为轻斑驳。病叶进行液氮速冻后，保存于-80℃超低温冰箱。

1.2 叶片总RNA抽提

试验于2017～2018年在湖南省农业科学院植物保护研究所进行。叶片总RNA抽提采用Trizol法（Invitrogen）。在通风橱中用研磨棒充分研磨约100 mg冷冻叶片，加入1 mL Trizol振荡15 s，室温静置4 min；加入200 μL氯仿，漩涡振荡30 s，室温静置 3 min；4 ℃下 12 000 r·min-1离心 15 min；移取500 μL上清液至新RNase-free离心管中，加入等体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，-20 ℃静置30 min；4 ℃下 12 000 r·min-1离心 10 min；弃掉上清液，用新配的75%乙醇洗涤沉淀，8 000 r·min-1离心3 min；重复洗涤1次；弃上清液，8 000 r·min-1离心30 s，小心吸出上清液；室温晾干，取30 μL RNase-free H2O溶解，测定OD260/OD280值，检测RNA的含量和纯度，于-80 ℃保存备用。

1.3 引物设计与合成

引物设计根据Genbank中CpMMV基因组序列〔Genbank登录号：KJ534277，KC884249（Glycine max），KC884245（Glycine max），NC014730（Vigna unguiculata），KC774020〕作为靶标序列，选择CpMMV基因组序列相对保守区域，采用Primer Premier 5.0软件设计5对引物（表1）扩增CpMMV全基因组序列，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 CpMMV全基因组扩增引物

1.4 RT-PCR扩增和序列测定

RT-PCR采用1st Strand cDNA Synthesis试剂盒（Takara）和 KOD DNA polymerase（Toyobo），具体参数参考说明书。PCR反应体系（50 μL）包括PCR Buffer 25 μL、上游 /下游引物（10 μmol·L-1）各 2.0 μL、dNTP Mix 1.0 μL、总 RNA 1.0 μL、酶混合液1.0 μL，补足ddH2O至50 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性 3 min；95 ℃ 35 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 1.5 min，35个循环；最后72 ℃ 5 min。PCR产物采用MiniBEST Agarose Gel DNA纯化试剂盒（Takara），纯化PCR片段克隆到pEASY-T5载体，重组载体送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.5 序列拼接与分析

测定序列采用DNAstar 8.0软件中的Seqman进行拼接，拼接后的序列同源性分析采用Genbank的 nblast进行在线分析（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。序列系统发育树采用 MEGA v5软件构建（Tamura et al.，2011），序列重组分析采用RDP v3软件（Martin et al.，2010）进行。

2 结果与分析

2.1 海南地区CpMMV田间症状

从图1可以看出，疑似感染CpMMV的豇豆中下部叶片症状明显，病叶症状为轻斑驳或斑驳黄化；上部叶片症状较轻，表现为轻微斑驳褪绿；部分植株稍矮化，少量病叶片表现为轻微畸形。

图1 感染豇豆轻斑驳病毒的豇豆叶片（自然发病）

2.2 CpMMV基因组序列特征

RT-PCR检测结果表明，采集的5份样品均感染CpMMV，且PCR片段序列的核苷酸同源性高达100%，因此，随机选择其中一个样本进行CpMMV全基因组测序。抽提总RNA，采用5对特异性引物进行RT-PCR扩增，以未添加模板作为阴性对照（CK）。从图2可以看出，RT-PCR扩增得到了单一、与预期大小（800、1 253、2 297、2 205、3 052 bp）一致的目的条带。将这些条带纯化后，连接T载体，采用通用引物进行测序。测序获得序列利用 NCBI（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov）的VecScreen在线工具去除载体序列，采用DNAstar 8.0软件中的Seqman进行拼接。拼接得到的CpMMV海南分离物基因组长度为8 193 bp，GenBank登录号为KY420906。 CpMMV基因组3′UTR和 5′ UTR的长度分别为121 bp和72 bp。

图2 RT-PCR扩增结果

2.3 系统发育分析

CpMMV的基因组同源性比对结果表明，CpMMV海南分离物基因组序列与美国佛罗里达分离物（KC774019）的同源性最高，为83.22%；与加纳分离物（NC014730）的同源性最低，仅为63.00%。Genbank中共登录有9条CpMMV基因组序列，全部下载后与CpMMV海南分离物进行序列联配，进行系统发育分析（图3）。所有CpMMV分离物大致可以分为3个亚簇，分别是巴西-美国亚簇、加纳亚簇，以及CpMMV海南分离物亚簇。

图3 CpMMV海南分离物基因组系统发育分析

2.4 重组分析

基于CpMMV基因组，采用RDP软件分析重组事件（图4），CpMMV海南分离物具有一个重组位点，其断点为3 212～3 592 bp。重组片段的主要父本为加纳分离物（NC014730）、次要父本为美国佛罗里达分离物（KC774020）。

图4 CpMMV海南分离物重组分析

3 结论与讨论

1973年首次发现CpMMV侵染豇豆（Brunt & Kenten，1973）， 但是我国直到2019年才有CpMMV发生的报道（刘勇 等，2019）。CpMMV能够侵染豆科和茄科多种蔬菜作物，可种传、也可由烟粉虱传播，其传播速度快，目前已广泛分布于亚洲、美洲和非洲（Brito et al.，2012；Rosario et al.，2014）。CpMMV单独侵染，其症状相对较轻，然而与其他植物病毒复合侵染，可导致严重的产量损失（Nsa & Kareem，2015）。因此，应加强该病毒的监测，预防该病毒在我国豆科和茄科等重要经济作物发生流行。

本试验结果表明，CpMMV海南分离物的基因组序列与美国分离物的同源性较高，但与非洲加纳分离物的同源性较低，表明CpMMV在不同地域存在遗传分化；基于CpMMV基因组序列的系统发育分析也进一步证实该结果。CpMMV巴西-美国分离物聚为一个亚簇，非洲加纳和我国海南分离物各聚为一个亚簇，表明CpMMV的亲缘关系可能与地理位置有直接联系。因此，需测定更多CpMMV分离物的基因组序列，分析该病毒的遗传分化特点，为该病毒的致病性研究提供科学依据。

重组在植物病毒的遗传变异中发挥重要作用（Nagy，2011），CpMMV海南分离物的重组分析表明，在其基因组3 212～3 592 bp具有一个重组事件，其重组片段可能来源于美国和加纳分离物之间的重组。表明CpMMV的亲缘关系虽然与地理位置有关，然而来源于不同地域的分离物的重组，可促进该病毒适应新地理位置的寄主，从而促进该病毒的快速扩展。因此，需进一步开展该病毒的快速检测技术、病毒遗传变异等研究，为明确该病毒在我国的分布、流行性和致病性等研究提供技术手段和理论基础。