高强度间歇运动加重溃疡性结肠炎小鼠炎性反应的影响

黄 凯，王大宁，彭 朋，秦永生，李学恒

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是特发于结肠的慢性非特异性炎性反应，属消化系统常见病，其病程较长且易复发，可使患者生活质量明显下降。UC在欧美国家较为常见，近年来在我国的发病率也呈持续上升趋势，目前临床上尚无根治UC的药物和方法，且易复发。因此，探索作用持久且不良反应小的药物及非药物治疗手段与有效的预防策略势在必行[1]。目前已证实，运动是防治多种慢性病(肥胖、糖尿病、高血压等)的重要手段，同时也是临床治疗的有益补充。前期的研究发现，中低强度持续有氧运动(continuous aerobic training，CAT)可减轻缓解期UC患者及UC小鼠的临床症状并降低炎性反应[2，3]。高强度间歇运动(high-intensity interval training，HIIT)是近年来新兴的一种运动模式，与传统CAT相比，具有省时有效等特点。Ploeger等[4]以克罗恩病(与UC同属炎性反应性肠病)患者为受试对象，结果发现，HIIT并未显著上调血浆炎性反应因子水平，且患者并无不良反应，初步证实了HIIT的安全性，然而长期HIIT对UC的作用尚未明确。本研究旨在探讨8周HIIT预适应对葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium，DSS)诱导C57BL/6小鼠实验性UC临床症状和炎性反应的影响，为制定针对UC的最佳运动处方提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 45只8周龄雄性C57BL/6小鼠，体重18～20 g，购自军事医学科学院实验动物中心。分笼饲养(5只/笼)，自由进食水。实验动物适应1周后将其随机分为3组，安静对照组(rest control，RC)、安静造模组(rest model，RM)和运动造模组(exercise model，EM)，每组15只。

1.2 干预方法 RC组安静饲养8周后自由饮用蒸馏水7 d；RM组安静饲养8周后自由饮用3.5% DSS溶液(w/v)7 d进行UC造模；EM组进行8周HIIT后行UC造模(造模方法同RM组)。EM组运动预适应方案为：先进行5 min跑台热身运动(10 m/min)，之后以15～28 m/min速度运动4 min(8周内跑速逐渐增加)、间歇2 min为1个循环，共完成10个循环，5周/次，共8周。

1.3 观察与评分 (1)疾病活动指数(disease activity index，DAI)评分：每天记录动物体重、大便性状和便血情况(临床症状)，按参照文献[5]将上述三个方面的评分相加后取平均数作为DAI。(2)动物取材：末次实验结束后48 h麻醉动物，灌肠，取盲肠远端至肛门部分结肠组织，测量其长度。随后沿肠系膜剪开肠腔，生理盐水冲洗后留取远端结肠，将组织分为两部分，一部分制作病理组织切片，另一部分用锡纸包裹投入液氮中并迅速转入-80 ℃低温冰箱冻存，待测炎性反应因子基因表达。(3)结肠组织病理学观察与评分：取结肠组织用10%中性甲醛固定，石蜡包埋，5 μm切片后行苏木精-伊红(hematoxylin and eosin，HE)染色，中性树胶封固。于光学显微镜下进行组织病理学观察(结构破坏、隐窝丢失状况、炎性浸润等)并参照文献[5]进行组织病理学评分。(4)结肠炎性反应因子mRNA表达量：利用电动匀浆器将结肠组织匀浆后，使用Trizol试剂盒提取组织总RNA，反转录反应获得cDNA，实时荧光定量PCR仪(9600，美国PE)测定结肠炎性反应因子-白细胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)、IL-6和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)mRNA表达量，以β-actin作为内参基因，各组mRNA相对表达量以RC组的倍数表示。

2 结 果

2.1 样本量分析 造模期间，EM组拒跑1只，死亡2只，RM组死亡1只，最终样本量为41只，各组分别为：RC组15只，RM组14只，EM组12只。

2.2 各组体重和DAI评分的变化 体重：造模期间，RC组体重无显著性变化(P>0.05)，RM和EM组体重从第5 天开始下降并持续至第7天，差异有统计学意义(P<0.05)，EM组体重在第6天和第7天均低于RM组(P<0.05，图1)。DAI评分：造模期间，RC组DAI评分均为0，第3天开始，RM和EM组DAI评分开始升高并持续至第7 天，差异有统计学意义(P<0.05)，EM组DAI评分在第5～7 天高于RM组，差异有统计学意义(P<0.05，图2)。

图1 3组小鼠造模期体重的变化

与RC组比较，①P<0.05；与RM组比较，②P<0.05

2.3 结肠长度及组织病理学观察 (1)结肠长度：与RC组[(8.2±1.5)cm]比较，RM组[(7.1±1.3)cm]和EM组[(5.7±1.6)cm]结肠长度缩短, 差异有统计学意义(P<0.05)；EM组结肠长度低于RM组, 差异有统计学意义(P<0.05)。(2)结肠组织病理学观察与组织病理学评分：RC组细胞排列整齐、结构完整、腺体丰富, 无杯状细胞缺失及炎性细胞浸润；RM组小鼠肠黏膜水肿、细胞排列紊乱、炎性反应细胞浸润、杯状细胞缺失、溃疡形成，组织病理学评分为(2.8±0.6)高于RC组的(0.3±0.1)，差异有统计学意义(P<0.05)；EM组较RM损伤程度加重，组织病理学评分(3.6±1.0)高于RM和RC组, 差异有统计学意义(P<0.05,图3)。

图2 各组DAI评分的变化

与RC组比较，①P<0.05；与RM组比较，②P<0.05

图3 结肠病理组织HE染色(×200)

2.4 结肠炎性反应因子表达的变化 与RC组比较，RM和EM各组炎性反应因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)mRNA表达量升高(P<0.05)；与RM组比较，EM组IL-1β和TNF-α mRNA表达量进一步上调，差异有统计学意义(P<0.05，表1)。

表1 各组结肠炎性反应因子mRNA表达水平

注：与RC组比较，①P<0.05；与RM组比较，②P<0.05

3 讨 论

研究发现，规律运动具有抗炎效应，能够对炎性反应相关疾病(如肥胖、动脉粥样硬化、哮喘等)产生治疗或预防作用，然而关于体力活动与UC的关系至今尚无定论。横断面调查发现，久坐少动生活方式是UC的重要危险因素[6]，但队列研究的结果却相反。针对缓解期UC患者的临床研究发现，传统CAT能够缓解患者症状或无明显作用[2, 6，7]，因此针对UC患者特异性运动处方(运动方式、运动强度、运动时间及运动频率等)仍未确定。

动物实验一般采用运动预适应方案，其机制在于反复运动刺激诱导机体产生适应性变化，机体对于随后的不良应激源(生物、物理、化学、心理、社会等)耐受性增强。前期的研究证实，随意转轮运动[3, 8](属CAT模式)可改善实验性UC模型炎性反应与临床症状。HIIT作为一种省时有效的运动模式，与CAT相比，其对心肺和代谢系统的影响相似，对骨骼肌的作用更佳，然而HIIT与肠道的关系鲜有关注。我们推测，HIIT理应对UC产生有益效应。本研究以C57BL/6小鼠为实验动物，以DSS为诱导剂成功制作UC模型(即与RC组比较，RM组小鼠结肠长度缩短，DAI、组织病理学评分及炎性反应因子IL-1β、IL-6和TNF-α表达量升高)，以跑台HIIT为运动模式，结果发现，与RM组比较，EM组结肠长度缩短，DAI、组织病理学评分及炎性反应因子IL-1β和TNF-α mRNA含量进一步上调，提示8周HIIT预适应加重UC临床症状与炎性反应。

Cook等[9]同样以DSS诱导小鼠UC为模型证实，随意转轮运动减轻而持续跑台运动则加重结肠炎病情。他们认为，跑台运动属于被动运动，可造成实验动物心理应激。Reber等[10]发现，小鼠接受拥挤应激后再饮用DSS溶液进行UC造模，使结肠炎的症状进一步加重。由此推测，跑台运动方式造成动物慢性心理应激是本研究中EM组UC症状加重的原因之一。然而Bilski等[11]研究发现，持续跑台运动可减轻三硝基苯磺酸(trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS)诱导的大鼠UC临床症状并下调炎性反应因子表达水平。研究结果存在差异可能与动物种属及造模方式(DSS vs. TNBS)等因素有关。

剧烈运动或力竭运动可诱导机体产生暂时性炎性反应并伴随细胞因子含量上调，这一效应与运动强度和运动时间呈剂量-反应关系，因此运动疗法的健康效应具有运动负荷(运动强度×运动时间)依赖性，长时间高强度剧烈运动可导致胃肠功能紊乱，而中等强度则产生保护效应。针对缓解期UC患者的研究显示，12周HIIT和CAT均可改善患者运动能力和生活质量，但以HIIT的作用更佳[12，13]，但该研究并未测定炎性反应因子水平。本研究中运动强度、持续时间、完成组数及运动频率均明显优于张艳等[13]的研究，因此运动强度过高、持续时间过长造成的运动负荷过重是UC小鼠病情恶化的另一原因。Moraska等[14]发现，8周高强度跑台运动造成健康大鼠肾上腺肥大和胸腺萎缩，提示高强度运动诱导身体应激反应，与上述提及的心理应激共同作用于机体，导致免疫-内分泌系统功能紊乱，进而引起UC小鼠炎性反应加重。

此外，与其他组织器官不同，肠道内存在多种微生物并外界相通，其特殊的解剖结构决定易受应激性损伤[15]，人类肠易激综合征也证实了这一点。研究发现，肠道微生物多样性下降是UC的重要发病机制[16]。横断面研究证实，规律有氧运动能够增加肠道微生物多样性，进而对多种炎性反应性疾病具有预防及治疗作用[17]。Allen等[18]指出，不同运动方式对肠道菌群的调控存在显著差异。随后的研究进一步证实，UC小鼠被动运动(跑台)通过上调肠道上皮细胞趋化因子配体表达而促进细菌微生物从肠腔面向黏膜层转移，同时对巨噬细胞产生趋化效应，进而诱导炎性反应[9]。因此推测本研究中跑台HIIT造成的肠道菌群失衡可能也是UC症状恶化的原因之一。

总之，长期HIIT预适应加重DSS诱导UC小鼠临床症状和炎性反应，因此HIIT的健康效应及安全性尚需更多实验证实。