F血红蛋白酸洗脱液温度对Kleihauer-Betke实验准确率的影响

朱宏远，樊 斐，曹 正，陈可心，曾甲子，谢 鑫，杨丽珺

近些年来，一种较为少见的产科疾病——胎母输血综合征(fetomaternal emorrhage,FMH)逐渐被人们所重视。FMH是指一定量的胎儿血液通过破损的胎盘绒毛间隙进入母亲体内血液循环，所引起的胎儿不同程度的失血及母亲和胎儿溶血性输血反应的临床综合征。因为其发病隐匿，临床表现无特异性，不易做出早期诊断，常引起胎儿严重贫血、水肿，围生儿病死率高[1-4]。Kleihauer-Betke(K-B)实验是目前各医院最常用的定量检测母体血液循环中胎儿红细胞数目的方法,可以确诊并估计胎儿出血量，从而判断胎儿失血的严重程度[5]。在临床实验过程中发现，酸性洗脱液的温度是影响K-B实验结果的关键因素之一，本研究通过比较研究，旨在确定合适的酸性洗脱液温度。

1 对象与方法

1.1 对象 选择2018-01至2018-04在北京妇产医院就诊的孕妇作为研究对象，以K-B实验检测结果≤0.1%的EDTA抗凝成人静脉血为阴性对照组，EDTA抗凝脐带血为阳性对照组。取同血型的脐带血和未孕女性静脉血定量混合作为检测样本，配制成脐带血百分比含量为0.5%、1%、3%、5%、10%的5个水平的实验组检测样本。已发生明显溶血的标本和K-B实验检测结果>0.1%的静脉血标本不宜用作检测样本的制作。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器 Olympus DP26光学显微镜；胎儿红细胞计数软件系统(北京穗加)。

1.2.2 试剂 80%乙醇(分析纯)、95%乙醇(分析纯)、苏木精(分析纯)、25%盐酸(分析纯)、氯化高铁(分析纯)、1%伊红溶液均购自北京化工厂。pH(1.65±0.1)酸性洗脱液配置：由洗脱液A液与洗脱液B液按照5∶1混匀。洗脱液A液配置：苏木精0.75 g溶于95%乙醇100 ml混匀；洗脱液B液配置：氯化高铁2.4 g溶于25%盐酸2 ml，混匀后，加入蒸馏水至100 ml。

1.3 方法

1.3.1 血涂片的制备 实验组和对照组的血液均以抗凝静脉血(1.5～2.2 mg/ml EDTA-K2 抗凝)作为血液来源，按照常规方法推制血涂片。

1.3.2 K-B实验检测血红蛋白F (1)将血涂片自然干燥10 min，再用80%乙醇固定5 min，水洗待干；(2)配置酸性洗脱液；(3)将酸洗脱液均匀滴在固定好的血膜上，保温洗脱1 min后，水洗待干；(4)用1%伊红染液染1 min，水洗待干后镜检，在油镜下，含有胎儿红细胞的血红蛋白(HaemoglobinF，HbF)的红细胞被伊红染液染成鲜红色为阳性细胞，仅留下淡影的细胞膜者为阴性红细胞；(5)利用北京穗加软件有限公司开发的胎儿红细胞计数软件系统，进行计数1000个以上红细胞中胎儿阳性红细胞所占百分率，作为胎儿红细胞染色结果。根据《全国临床检验操作规程》(第三版)，成人血红蛋白F酸洗脱染色结果应小于1%，故将HbF水平小于1%为阴性结果，HbF水平大于1%为阳性结果[6]。

1.3.3 不同洗脱液温度的比较 分别制作脐带血含量为0.5%、1%、3%、5%、10%的5个标准水平的混合血液为检测样本，每一个水平的检测样本混合均匀后制作8张血涂片，均分用于两个组。将1.3.2步骤(3)中洗脱环节温度分别定于37 ℃和45 ℃，分别进行K-B实验染色，最后分析实验结果确定最适的洗脱温度。

1.4 统计学处理 采用SPSS21.0统计学软件进行统计学分析，两组样本分别进行单组样本均数的t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 穗加胎儿红细胞计数软件系统与常规光学显微镜下的效果比较 图1所示，穗加胎儿红细胞计数软件识别每一个空泡样阴性母血红细胞，并标注为蓝色；识别红色浓染的阳性胎儿红细胞，标注为红色；计数1000个以上红细胞中胎儿阳性红细胞所占百分率。与光学显微镜相比,穗加胎儿红细胞计数软件不仅具有简便快速的优势，还弥补了光学显微镜下计数准确率低、结果偏差大等诸多缺点，故本研究使用该软件进行计数。

图1 胎儿红细胞计数两种方法效果比较

2.2 洗脱温度染色结果比较 如图2A所示，洗脱温度37 ℃时，成人红细胞也被伊红染成了浅粉色，没有形成无色透明空泡样，与含有HbF的胎儿红细胞未形成鲜明对比；洗脱温度为45 ℃时，成人红细胞呈现无色透明空泡样，与被伊红染成浅粉色的含有HbF的胎儿红细胞形成鲜明对比(图2B)。

图2 胎儿红细胞不同洗脱温度染色结果比较

2.3 不同温度下K-B实验结果的比较 按照1.3.3进行实验，结果如表1所示，当样本为阴性标本时(<1%)，洗脱温度无论是37 ℃还是45 ℃，K-B法检测结果与标准值之间的差异均无统计学意义；当标本为阳性标本时(≥1%)，洗脱温度定为37 ℃的检测结果与标准值之间的差异有统计学意义(P<0.05)，而45 ℃的检测结果与标准值之间的差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 胎儿红细胞不同洗脱温度染色结果 (%)

3 讨 论

目前，穗加胎儿红细胞计数软件是国内唯一的一款全自动胎儿红细胞计数系统，依据图像色差原理专为F血红蛋白酸洗脱实验所创。实验室定量检测母血中胎儿红细胞是确诊FMH的直接依据，而K-B法是目前应用最广泛的实验室定量检测母血中胎儿红细胞的方法[7，8]。K-B实验，又称为酸洗脱实验，其原理为：胎儿红细胞和成人红细胞所含血红蛋白种类不同，胎儿红细胞的血红蛋白为HbF，而成人红细胞的血红蛋白为HbA。HbF的抗酸能力强，置酸性洗脱液中一定时间只有含HbF的红细胞不被洗脱，被伊红染色为粉红色。通过计数粉红色细胞占全部红细胞的比例以确定胎儿红细胞的比例。但实际工作中K-B实验操作不规范，脱色时间短时，容易将不含HbF细胞错误地计入胎儿红细胞，影响实验结果的准确性。因此，有一个实验效果优良、结果准确可信的K-B实验方法十分重要[9，10]。

在临床实验工作中我们发现洗脱液的温度对实验结果有一定的影响，基于此思路，本研究分别在洗脱液温度37 ℃和45 ℃下进行实验，本研究结果可以说明洗脱温度定为45 ℃相比于37 ℃可产生更好的洗脱效果，胎儿红细胞与成人红细胞区分明显，计数结果也更加准确，可以有效解决洗脱效果不好、易给实验人员造成视觉干扰等问题。当检测样本为阴性标本时，洗脱温度无论是37 ℃还是45 ℃，检测结果与标准值之间的差异均无统计学意义；当检测标本为阳性标本时，洗脱温度定为37 ℃的检测结果与标准值之间的差异有统计学意义，而45 ℃的检测结果与标准值之间的差异无统计学意义。综上所述，将穗加胎儿红细胞计数软件与F-蛋白酸洗脱实验45 ℃水浴相结合，大大提高了实验的效率、阳性检出率及准确率等，为FMH的诊治和预后判断提供了良好的实验室数据支持。

目前K-B法应用广泛，具有使用仪器少、方便快捷、适合急诊夜班使用的优点[11]，而其缺点是对实验者操作要求较高、容易受到温度等外在因素的干扰、大量的细胞计数易导致实验者视觉疲劳、缺乏有效的质量控制体系等，并且有研究发现，K-B法导致的假阳性率较高且重现性低[12]。