香蕉皮内生细菌的分离纯化及初步鉴定

王福彬，雒晓芳,郑青波,刘传丽,罗 前,朱 凯

(1.西北民族大学 生命科学与工程学院,甘肃 兰州 730030;2.西北民族大学 实验教学部,甘肃 兰州 730030)

内生菌是指存活于植物组织内,但不引发宿主植物出现明显感染症状的微生物类群,其与宿主存在着和谐的共生关系[1-4].存在新鲜果皮中的内生菌具有着广阔的研究前景和利用价值.香蕉(MusananaLour.)芭蕉科芭蕉属植物,又指其果实,热带地区广泛种植.而在我国香蕉已有3000多年的栽培历史[5],因其气味芬芳,肉质软而滑腻,爽口甘甜,深受人们的喜爱.香蕉被联合国粮农组织(FAO)定位为发展中国家仅次于水稻、小麦、玉米之后的第四大粮食作物.据统计，2009年农产品贸易中,香蕉仅次于小麦、大豆和玉米,位居第4位[6].香蕉中香蕉皮占全果质量的35%～41%[7].生活中,香蕉皮一般会被使用者直接丢弃,易造成环境的污染[8].本试验从新鲜香蕉皮中分离纯化一株未知细菌,并对该菌株进行细菌特征观察、生理生化鉴定及16S rDNA基因序列分析.目前,对香蕉皮的研究主要是对香蕉皮色素的提取、有效活性物质提取等[9],而关于香蕉皮内生菌的研究鲜有报道.而本研究为对一株来源于香蕉皮的内生菌进行分离鉴定,并对其生物活性开展的研究,具有重要的现实意义和开发利用的潜力,为香蕉皮内生菌种的开发和利用奠定了研究基础.

1 材料

1.1 实验材料

市售新鲜香蕉:香蕉皮表面含有少量黑斑或无黑斑.

1.2 培养基

LB固体培养基:胰化蛋白胨10 g，酵母提取物5 g,NaCl 5 g,15 g琼脂粉,摇动容器直至溶质溶解.用5 mol/L NaOH调pH至7.4,去离子水定容至1 L.加热溶解,121 ℃高压灭菌30 min.

1.3 试剂

硫酸双氢链霉素、青霉素G钾、PCR试剂盒、乳酸石炭酸棉蓝染色液、5%石炭酸水溶液、75%酒精、0.1%升汞等.

1.4 仪器

生化培养箱(ZHWY-200D)、超净工作台、生物显微镜等.

2 实验方法

2.1 菌种分离及形态学观察

选取新鲜香蕉皮,用无菌水、75%酒精和0.1%升汞处理后，切成均匀小片,与果肉接触部分置于含链霉素(50～100 mg/L)和青霉素(100～300 mg/L)的LB培养基上.于25～35 ℃黑暗条件下培养,待平板上长出肉眼可见的菌落时,采用平板划线的方法分离细菌,继续培养.连续多代纯化,即可获得生长优良的菌种,将所得的纯化菌株接种到斜面上,4 ℃冰箱中保存.选择形态特征明显的单一菌落,观察其形态特征及其生长情况,并挑取培养基上的菌落进行革兰氏染色,镜检观察.

2.2 细菌的生理生化鉴定

将纯化后的菌株纯培养物进行糖发酵试验、尿素试验、硝酸盐还原试验、枸橼酸盐试验等各项生理生化试验.置于34 ℃恒温培养24 h,根据东秀珠等人所著的《常见细菌系统鉴定手册》判定结果.

2.3 细菌的16S rDNA基因序列扩增及其序列分析

采用细菌基因组DNA提取试剂盒,按照革兰氏阴性细菌提取基因组的方法,提取需鉴定菌株的基因组.按照细菌基因组提取试剂盒说明书提取目标菌株的基因组DNA,以其为模板,利用16S rDNA序列扩增通用引物进行PCR扩增.PCR产物的核酸序列送往兰州领先生物技术有限公司进行测序.测序结果与NCBI中的BLAST程序进行序列同源性比对分析,选取与分离菌序列相似性高的序列,利用MEGA5.1软件手动调整序列,自展数(bootstrap)为1 000,模型Kimura 2-parameter model(K2),构建邻接法(Neighbor-joining,NJ)系统发育树.

3 结果与分析

3.1 形态学特征

经形态学初步鉴定表明,该菌株为革兰氏阴性,球杆状,不运动,单个或多个排列,不产芽孢.在LB培养基中34 ℃培养24小时,形成圆形、隆起、边缘整齐、表面粗糙、干燥粉末状,初期呈白色,后期中间呈墨绿色，边缘呈白色的菌落,产黄色素.初步命名为W.

3.2 生理生化特征

该细菌的生理生化特征符合不动杆菌的基本特征,不能降解硝酸盐、淀粉、蔗糖、阿拉伯糖、麦芽糖、葡萄糖、乳糖、棉子糖、甘露糖,但可以利用甘露糖、尿素(见表1).

表1细菌W生理生化鉴定结果

3.3 16S rDNA基因序列测定结果及系统发育树分析

根据相关文章表明[10-13],一般16S rDNA序列同源性大于99%,可以认为是同一个种.16S rDNA序列同源性小于98%,可以认为不属于同一个种.同源性小于95%,可以认为不属于同一个属.

经鉴定，细菌W的16S rDNA的1411个核苷酸得到有效的扩增.将细菌W的16S rDNA基因序列进行Blaste比对分析,发现与GeneBank数据库中的Acinetobacterguillouiae不同菌株16S rDNA 序列的相似性高达99%.系统发育树结果显示,分离菌W与Acinetobacterguillouiae聚为一簇,亲缘关系最近,而与其他细菌亲缘关系较远.结合生理生化特征,可判断分离菌属于不动杆菌属.

图1细菌W的16SrDNA全序列的系统发育树

4 讨论

不动杆菌是条件致病菌,根据相关文章报导[14-15],其广泛分布于水、土壤、医院环境和人体皮肤表面,而不同种类的不动杆菌在外界的分布情况，到目前为止还没有系统的研究.据相关报导[16-17],在43%健康个体的皮肤上可分离到不动杆菌,也可在健康成年人的口腔及呼吸道分离得到.所以它已成为医院获得性感染的主要致病菌之一,因此如何治疗不动杆菌引起的感染已成为临床关注的重点.近年来,还发现某些不动杆菌还具有降解多环芳烃的作用,所以,不动杆菌在石油污染的环境治理中有着良好的研究价值，在石油烃降解方面具有良好的应用前景.

到目前为止,鲜有关于从香蕉皮中分离得到不动杆菌属细菌的报导,而本研究从新鲜香蕉皮中分离纯化获得一株内生菌,并对该菌进行形态特征观察、生理生化鉴定试验以及16S rDNA基因序列的分析,确定了该菌为不动杆菌属细菌.该菌种在香蕉皮中的发现丰富了不动杆菌属细菌的分布,也为香蕉皮内生菌种的进一步开发和利用奠定了研究基础,因此本研究工作具有重要的理论意义和潜在的应用价值.

5 结论

本研究从新鲜香蕉皮中分离出未知菌W,对其进行了13项生理生化试验，反应结果与不动杆菌属细菌生理生化指标相似.对该菌株的16S rDNA基因序列进行测序分析,通过Blaste与GenBank中相关数据比对以及利用MEGA5.1软件构建系统发育树,分析结果表明，该菌株与Acinetobacterguillouiae的相似性最高,因此判断该菌株W为不动杆菌属细菌.