荒漠肉苁蓉总苷大孔吸附树脂纯化工艺

余逸凡，石秋慧，谭金晶，阿巧生，康淑荷

(西北民族大学 化工学院，甘肃 兰州 730106)

列当科(Orobanchaccae)肉苁蓉属(Cistanche)植物荒漠肉苁蓉(CistanchedeserticolaY.C.Ma)为西部沙漠地区的特产，有“沙漠人参”之称，具有补精血、益肾壮阳、润肠通便之功效[1].富含苯乙醇苷类、木脂素及其苷类、环烯醚萜及其苷类、黄酮类等化学成分[2-4 ]，具有抗辐射、增强机体免疫功能、调节神经系统、促进记忆、肝保护、提高性功能及抗衰老等作用[5-7].目前,徐常永等[8]对肉苁蓉(产地不明)总黄酮采用大孔树脂进行了研究，王秀海等[9]优化了AB-8大孔吸附树脂纯化新疆和田产管花肉苁蓉Cistanchetubulosa( Schrenk) Wight总苷的工艺.甘肃荒漠肉苁蓉资源丰富，种植面积超过13.3 km2.鉴于产地、植物种类及采集时间等对植物化学成分及含量均有影响，本实验以甘肃武威产的荒漠肉苁蓉为原料，以松果菊苷为标准对照品，从六种大孔吸附树脂(AB-8、 HPD-100、 D-101、HPD-826、 DM-130、 NAK-9)中，优选出纯化该植物总苷的较佳树脂D-101.对D-101分离纯化荒漠肉苁蓉总苷的工艺，采用L9(34)正交设计优化，为进一步开发利用荒漠肉苁蓉提供实验依据.

1 材料与仪器

1.1 材料

荒漠肉苁蓉2017年2月采集于甘肃省武威市甘肃蓉宝生物科技有限公司种植基地，经康淑荷副教授鉴定为列当科(Orobanchaccae)肉苁蓉属Cistanche植物荒漠肉苁蓉CistanchedeserticolaY.C.Ma，切片速冷风干，粉碎，过40目筛，备用.

松果菊苷对照品(批号：20180218，纯度>99%，天津市北辰方正集团)；大孔吸附树脂AB-8、HPD100、D101、HPD826、DM130、NAK-9(安徽三星树脂有限公司)；超纯水；其他试剂均为分析纯.

1.2 仪器

Heλiosβ紫外可见光谱仪：美国热电；Advanced-I-24L艾柯实验室超纯水机：成都艾柯水处理设备公司；YQ-620C超声仪：上海易净超声波仪器公司；ZA100R3电子天平；上海赞维衡仪器公司；6210立式真空干燥箱:上海东麓仪器设备公司.

2 方法

2.1 荒漠肉苁蓉溶液制备

称量500 g预先处理好的荒漠肉苁蓉粉末，加入10倍70%乙醇，超声(温度45 ℃、功率540 W)30 min后，再加热回流30 min，离心(4 000 r·min-1)分离，上清液真空抽滤，收集滤液.同法重复提取3次，真空浓缩(温度45 ℃)滤液，45 ℃真空干燥至恒重，得棕褐色荒漠肉苁蓉总浸膏144 g.

精密称定浸膏0.4 g，超纯水为溶剂，定容至200 mL棕色容量瓶中(总苷含量为0.044 mg·mL-1)，备用.

2.2 标准曲线

准确称量松果菊苷对照品10 mg，加入50%甲醇，定容至100 mL容量瓶内.分别量取0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL置于10 mL容量瓶中，加50%甲醇至刻度.配制不同浓度(以C表示)的标准溶液[9]，以紫外可见光谱仪全波长扫描，得到λmax=378 nm，在此λmax波长处测定标准品溶液的吸光度A.标准曲线以A为纵坐标，C为横坐标，回归线方程为A=10.185C-0.0009，R2=0.9999，线性范围为0.018 7～0.105 0.

2.3 静态吸附

分别准确称量六种大孔树脂100 g，按文献方法[10-11]处理，用超纯水洗至无醇味后，加入浓度为1.5 mg·mL-1的样品溶液200 mL，按文献[12-13]的方法，充分振荡后，静置24 h，真空抽滤，分别收集滤液和滤渣.测定滤液的吸光度A，计算荒漠肉苁蓉总皂苷的含量，计算吸附率=(C1V1-C2V2)/C1V1×100%，C1(mg·mL-1)为吸附前样品溶液中总皂苷的浓度；V1(mL)为吸附前样品溶液的体积；C2(mg·mL-1)为吸附后的流出液总皂苷的浓度；V2(mL)为吸附后的流出液体积.滤渣(过滤后的树脂)加入70%乙醇，充分振荡，静置12 h，过滤.测定滤液的吸光度，计算荒漠肉苁蓉总皂苷的含量，计算解吸率=C3V3/(C1V1-C2V2)×100%，C3(mg·mL-1)为解吸液中总皂苷的浓度；V3(mL)为解吸液的体积.计算回收率=吸附率×解吸率.

2.4 动态吸附

将2.3中优选出的较佳树脂D-101，称量5份，每份100 g，预处理后，分别进行湿法装柱，层析柱均为35 mm×500 mm.用超纯水洗至无醇味后[10-11]，选择D-101对总苷的吸附率为考察指标，70%乙醇为洗脱剂，考察上样浓度(0.5 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、1.5 mg·mL-1、2.0 mg·mL-1、2.5 mg·mL-1)、洗脱液流速(1.0 mL·min-1、2.0 mL·min-1、4.0 mL·min-1、6.0 mL·min-1)和洗脱液体积(2、4、6、8、10 BV)的影响.

2.5 正交实验

在2.4实验基础上，以A洗脱液流速(mL/min)、B洗脱液体积(BV)、C上样液浓度(mg·mL-1)为因素，荒漠肉苁蓉总皂苷吸附率为指标，正交设计助手IIV3.1中L9(34)进行正交实验(见表1).

表1正交实验设计

3 结果与分析

3.1 静态吸附

静态吸附结果(见图1),显示六种树脂吸附率由高到低的顺序为NAK-9>DM-130>HPD-826>HPD100>D-101>AB-8；解析率由高到低的顺序为AB-8>D101>HPD-826>HPD-100>DM-130>NAK-9；回收率由高到低的顺序为D-101>HPD-826>AB-8>DM-130>HPD-100>NAK-9.以回收率为主要参考指标，综合考虑吸附率及解吸率，选择D-101树脂进行动态吸附实验.

图1 六种树脂对总皂苷的吸附、解吸和回收率

3.2 动态吸附

3.2.1 上样浓度

当洗脱液流速为1.5 mL·min-1，洗脱液体积为5 BV时，不同上样浓度对吸附率的影响结果(见图2)表明：吸附率随着上样液浓度的增加依次递增.当上样液浓度达到1.5 mg·mL-1时吸附率达到最大，当上样液浓度继续增加时吸附率下降，故选择1.5 mg·mL-1为较佳上样浓度.

图2上样浓度的影响

3.2.2 洗脱液流速

当洗脱液体积为5 BV，上样浓度为1.5 mg·mL-1时，洗脱液流速的影响结果(见图3)显示：吸附率随着洗脱液流速的增大而增大，当洗脱液流速为2 mL·min-1时吸附率最大，达到了89.70%，此后，随洗脱液流速增大，吸附率迅速减小.选择2 mL·min-1为较佳洗脱液流速.

图3 洗脱液流速的影响

3.2.3 洗脱液体积

当洗脱液流速为2 mL·min-1，上样浓度为1.5 mg·mL-1时，洗脱液体积对总苷吸附率的影响结果表明：随着洗脱液体积的增加，吸附率也逐步增加.当洗脱液体积达到8 BV时吸附率达到最大，为79.15%.当洗脱液体积继续增加到10 BV时，吸附率不再增大，选择8 BV为洗脱较佳体积.

图4洗脱液体积的影响

表2以吸附率为考察指标的正交实验结果

3.3 正交实验结果与分析

以总苷吸附率为考察指标的L9(34)正交实验结果及直观分析见表2，(使用软件为正交设计助手IIV3.1)，方差分析见表3.

表3方差分析

表2中k1、k2和k3分别表示相应水平所得总苷吸附率的平均值，极差R=kmax-kmin，直观分析显示洗脱液流速(A)k2>k3>k1，洗脱液体积(B)k1>k2>k3，上样液浓度(C)k3>k1>k2，各因素R大小顺序为RA>RC>RB，表明各因素对总苷吸附率的影响依次为A>C>B.

由表3可知，洗脱液流速对总苷吸附率的影响具有显著性意义(P<0.05).

综上所述，确定D-101树脂分离纯化荒漠肉苁蓉总苷的较佳工艺条件为A2B1C3，即上样液流速2 mL·min-1，洗脱液体积6 BV，上样液浓度2 mg·mL-1.

3.4 工艺参数验证

以D-101树脂对荒漠肉苁蓉总苷的吸附率、解吸率和纯化前后总皂苷的质量分数为指标，按照3.3得到的较佳实验条件，重复3次,结果如表4显示.荒漠肉苁蓉总皂苷的质量分数由分离纯化前2.23%提高到了纯化后的64.38%，且实验RSD<2%.验证实验表明，D-101纯化荒漠肉苁蓉总苷的产率和含量稳定，表明实验优选的工艺分离效果好.

表4验证实验结果

4 结论

大孔吸附树脂具有环保、再生简单，且易于工业连续生产的优点.在6种树脂中，D-101树脂吸附及解析后的回收率最高，为纯化荒漠肉苁蓉总苷的理想树脂.纯化后的肉苁蓉总苷体外活性(抗自由基氧化的能力)明显高于纯化前，有关研究将在另一篇论文中报道.该研究结果可进一步进行放大实验，为工业生产提供参考.