miR-21对H2O2诱导的视网膜色素上皮细胞凋亡及PTEN/AKT通路的影响

马佳 周敏 张瑜 黄靖妍 高梦莹

年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)等眼底变性疾病是造成人类视力受损的主要原因[1]，视网膜色素上皮细胞凋亡是造成AMD等眼底变性疾病的主要原因[2]。以往对miRNA的研究主要集中在肿瘤形成中，近年来miRNA在视网膜色素上皮细胞凋亡中的研究逐渐增多[3]。有研究证明，miR-21在H2O2诱导的人眼小梁网细胞氧化应激损伤过程中异常表达[4]，但有关miR-21在视网膜色素上皮细胞中研究未见报道。因此，本研究探讨了miR-21对H2O2诱导的视网膜色素上皮细胞凋亡的影响及其相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人视网膜色素上皮细胞系ARPE-19，购于中科院细胞系；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)试剂盒购自武汉默沙克生物科技有限公司；体积分数50%H2O2购自南京化学试剂股份有限公司；DCFH-DA荧光探针购自美国Sigma公司；胎牛血清、DMEM培养基、RPMI-1640培养基、Lipofectamine TM 3000试剂盒购自美国Gibco公司；miR-21mimics及阴性对照物由南通市百奥迈科生物技术有限公司订购合成；FACSCanto流式细胞仪购自美国BD公司；兔源一抗[Bax、Bcl-2、Caspase-3、 磷酸酶(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)、p-AKT、AKT、GAPDH]购自美国Rabbit mAB；二抗辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔购自美国Cell Signal Technology。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与瞬时转染 从液氮罐中取出装有细胞系ARPE-19冻融管，0 ℃解冻完成后采用DMEM培养基，含体积分数为10%的新生牛血清、100×103U·L-1青霉素、100 mg·L-1链霉素，置于37 ℃、含体积分数5%CO2的恒温培养箱中培养24 h。转入离心管，10 000 r·min-1冷冻离心5 min，弃上清，加入DMEM重悬细胞，37 ℃培养箱中孵育。按照实验室方法进行细胞传代。

收集稳定传代细胞进行计数后接种，以每孔400×103个接种到细胞培养板上培养至细胞融合达到80%左右，更换为不含新生牛血清的RPMI-1640培养基，按照LipofectamineTM3000试剂盒操作说明书进行转染。将细胞分为四组：空白对照组、阴性对照组、H2O2组和H2O2+miR-21mimics组，每孔均加入1.5 μL Lipofectamine RNAiMAX，此外每组分别按照不添加、添加0.7 μL 20 μmol·L-1的miR-21阴性对照物、添加200 μmol·L-1H2O2、添加200 μmol·L-1H2O2+0.7 μL 20 μmol·L-1miR-21 mimics，每组设置6个重复。转染后进行常规培养48 h，收集各组细胞，供后续检测。

1.2.2 即时定量PCR检测 采用即时定量PCR(quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR)法测定细胞系ARPE-19中miR-21相对表达量。取各组处理后细胞，按照Trizol试剂盒说明书操作提取组织总RNA，按照miRNA反转录试剂盒操作步骤将2 μg RNA反转录为cDNA，miR-21正向引物为5’-GCGCATCGTTACCATCATCACG-3’，反向引物为5’-TTCTTCCTCTGTCCGACGGTCT-3’；U6正向引物为5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’，U6反向引物为5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’，之后按照SYBR Green RCR Master Mix试剂说明配制反应体系并加样。qRT-PCR反应体系共为20.0 μL：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10.0 μL，cDNA 2.0 μL，上下游引物各0.8 μL，ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μL，双蒸水6.0 μL。完成后将其放入荧光定量PCR仪上进行反应，程序设定为：95 ℃ 5 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，共40个循环。其中miR-21以U6为内参基因，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反应结束后整理数据，并对所得数据Ct值进行分析，采用2-ΔΔCt算法计算miR-21相对表达量[5]。

1.2.3 细胞内活性氧类水平测定 经处理后各组细胞继续培养48 h，PBS洗涤，加入含有20 μmol·L-1DCFH-DA的PBS，37 ℃孵育2 h，在流式细胞仪检测各组活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)生成量。

1.2.4 细胞内MDA、SOD水平测定 经处理后各组细胞继续培养48 h，离心收集细胞，反复冻融，取上清检测各组细胞MDA、SOD水平，严格按照试剂盒操作说明书进行。

1.2.5 流式细胞术检测各组细胞凋亡率 经处理后各组细胞，继续培养48 h，避光30 min上机检测。用2.5 g·L-1胰蛋白酶消化，PBS洗涤，2000 r·min-1离心5 min，收集细胞，按顺序加入500 μL Binding Buffer、5 μL Annexin V-FITC及5 μL PI，混匀，避光20 min，进行流式细胞仪检测。

1.2.6 Western blot检测 ARPE-19转染48 h后，用PBS缓冲溶液清洗细胞3次，离心收集细胞，抽提各组细胞总蛋白并测定蛋白浓度，以GAPDH作为内参照，每泳道加 40 μg 蛋白进行SDS-PAGE 电泳，将蛋白转至 PVDF 膜，印迹膜在含50 g·L-1脱脂奶粉的 PBST，缓冲液内室温封闭2 h，加入一抗(Bax、Bcl-2、Caspase-3、 PTEN、p-AKT、AKT、GAPDH，稀释度分别为1:200 、1:200、1:200、1:500、1:100、1:1000、1:1000)，4 ℃孵育过夜，洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG (工作浓度1:10 000)，室温孵育1 h。扫描拍照后进行图像处理与分析。

2 结果

2.1 各组细胞中miR-21表达 miR-21在各组相对表达量：空白对照组为2.45±0.49，阴性对照组为2.39±0.48，H2O2组为1.14±0.23，H2O2+miR-21 mimics组为2.18±0.44；空白对照组与阴性对照组miR-21表达量差异无统计学意义(t=0.364，P=0.459)；与空白对照组、阴性对照组相比，H2O2组、H2O2+miR-2 mimics组miR-21表达均显著降低(t=6.423、5.127、3.426、2.983，P=0.006、0.009、0.012、0.021)；与H2O2组相比，H2O2+miR-21 mimics组miR-21表达显著升高，差异有统计学意义(t=3.671，P=0.015)。

2.2 各组细胞内ROS、MDA、SOD水平 空白对照组与阴性对照组ROS、MDA、SOD水平差异均无统计学意义(均为P>0.05)；与空白对照组、阴性对照组相比，H2O2组、H2O2+miR-2 mimics组ROS、MDA水平显著升高(均为P<0.05)，SOD水平显著降低(均为P<0.05)；与H2O2组相比，H2O2+miR-2 mimics组ROS、MDA水平显著降低(均为P<0.05)，SOD水平显著升高(P<0.05)。见表1。

组别ROSMDA/mol·L-1SOD/U·L-1空白对照组20.11±5.011.54±0.3117.62±3.52阴性对照组21.19±5.541.60±0.3117.90±3.58H2O2组30.58±7.96ab3.95±0.79ab5.49±1.10abH2O2+miR-21 mimics组23.25±5.67abc2.13±0.43abc14.28±2.86abc

注：与空白对照组相比，aP<0.05；与阴性对照组比较，bP<0.05；与H2O2组相比，cP<0.05

2.3 各组细胞凋亡率的比较 各组细胞凋亡率分别为：空白对照组细胞凋亡率为(5.82±1.16)%，阴性对照组为(6.03±1.21)%，H2O2组为(25.48±5.10)%，H2O2+miR-21 mimics组为(17.63±3.52)%，空白对照组与阴性对照组细胞凋亡率差异无统计学意义(t=0.412，P=0.346)；与空白对照组和阴性对照组相比，H2O2组、H2O2+miR-21 mimics组细胞凋亡率均显著上升(t=6.957、5.753、4.213、3.527，P=0.005、0.008、0.010、0.019)；与H2O2组相比，H2O2+miR-21 mimics组细胞凋亡率显著下降，差异有统计学意义(t=3.507，P=0.020)。

2.4 视网膜色素上皮细胞凋亡相关蛋白表达结果 空白对照组与阴性对照组相比，细胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达差异均无统计学意义(均为P>0.05)，与空白对照组和阴性对照组相比，H2O2组、H2O2+miR-21 mimics组细胞中Bax、Caspase-3蛋白表达均显著上升(均为P<0.05)，Bcl-2蛋白含量下降(P<0.05)；与H2O2组相比，H2O2+miR-21 mimics组细胞中Bax、Caspase-3蛋白表达下降(均为P<0.05)，Bcl-2蛋白含量升高(P<0.05)。见图1、表2。

图1 免疫印迹检测凋亡相关蛋白表达。A：空白对照组；B：阴性对照组；C：H2O2组；D：H2O2+miR-21 mimics组

组别Bax蛋白Bcl-2蛋白Caspase-3蛋白空白对照组0.32±0.06 0.54±0.11 0.33±0.07 阴性对照组0.34±0.070.51±0.100.32±0.06H2O2组0.73±0.15ab0.34±0.07ab0.85±0.17abH2O2+miR-21 mimics组0.49±0.10abc0.62±0.12abc0.42±0.08abc

注：与空白对照组相比，aP<0.05；与阴性对照组比较，bP<0.05；与H2O2组相比，cP<0.05

2.5 各组细胞PTEN/AKT激活情况比较 空白对照组与阴性对照组相比，PTEN、PI3K、AKT蛋白表达差异均无统计学意义(均为P>0.05)。与空白对照组和阴性对照组相比，H2O2组、H2O2+miR-21 mimics组PTEN蛋白表达明显上调，p-PI3K、p-AKT蛋白表达明显降低。与H2O2组相比，H2O2+miR-21 mimics组中PTEN表达下调，p-PI3K、p-AKT表达上调(均为P<0.05)。见图2、表3。

图2 免疫印迹检测PTEN/AKT蛋白表达情况。A：空白对照组；B：阴性对照组；C：H2O2组；D：H2O2+miR-21 mimics组

组别PTEN蛋白p-PI3K/PI3K蛋白p-AKT/AKT蛋白空白对照组0.16±0.06 1.03±0.21 1.36±0.27 阴性对照组0.18±0.030.98±0.191.41±0.28H2O2组0.59±0.12ab0.46±0.09ab0.53±0.11abH2O2+miR-21 mimics组0.43±0.11abc0.68±0.13abc1.16±0.13abc

注：与空白对照组相比，aP<0.05；与阴性对照组比较，bP<0.05；与H2O2组相比，cP<0.05

3 讨论

AMD通常是高龄退化的自然结果，随着年龄增加，视网膜组织退化、变薄，引起黄斑功能下降。生理状态下，视网膜色素上皮细胞对维持正常视网膜功能，如光感受器更新和代谢、构成血-视网膜屏障，至关重要，视网膜色素上皮细胞对氧化应激极为敏感。Sparrow等[6]研究发现，大量ROS未能及时清除时可使机体发生氧化应激反应，诱导线粒体膜电位降低，线粒体细胞色素C释放到胞浆，触发并激活细胞的凋亡系统引起细胞凋亡。H2O2是一种氧化应激模型常用的诱导剂，本研究也使用H2O2诱导视网膜上皮细胞氧化应激模型。本研究发现，经H2O2诱导后视网膜色素上皮细胞中ROS、MDA含量升高，SOD含量下降，而ROS生成失衡会导致视网膜色素上皮细胞生长周期紊乱，过量的ROS诱导视网膜色素上皮细胞凋亡[7]。MDA是氧化应激终产物，SOD是人体内重要的抗氧化酶，均可反映氧化应激损伤程度。

miR-21是一种高度保守的内源性小分子RNA，定位于17号染色体，目前发现miR-21几乎在所有肿瘤中均呈高表达，通过PTEN/AKT通路抑制多种与肿瘤细胞增殖、凋亡和侵袭相关的抑癌基因而发挥作用[5，8-9]，但miR-21在氧化应激诱导的视网膜色素上皮细胞凋亡中研究较少。因此，本研究通过对H2O2诱导的视网膜色素上皮细胞凋亡模型的研究，探讨miR-21对H2O2诱导的视网膜色素上皮细胞凋亡以及PTEN/AKT通路的影响。本研究发现，转染miR-21 mimics后，视网膜色素上皮细胞中miR-21水平显著升高，提示转染效率较高；而且检测发现细胞中ROS、MDA水平降低，SOD水平上升，提示miR-21可能通过清除细胞内氧化应激产物ROS、MDA抵抗H2O2诱导的细胞氧化应激损伤。

已有研究表明，视网膜色素上皮细胞凋亡是造成AMD的主要原因，视网膜色素上皮细胞的损伤是不可逆的，只能依靠扩张填补缺损区[10]，因此减少视网膜色素上皮细胞凋亡对AMD等眼底变性疾病的治疗具有重要意义。张亚琴[11]在miR-21对氧化应激诱导的心肌细胞损伤的影响研究中发现，上调miR-21表达，细胞凋亡率降低。Zhou等[12]研究表明，miR-21在胃癌细胞中过表达。本研究中流式细胞术检测表明，H2O2组细胞凋亡率高，上调miR-21表达后，细胞凋亡率降低，提示miR-21可抑制细胞凋亡，与miR-21在结肠癌、胃癌等恶性肿瘤中发挥类似作用[13-15]。H2O2诱导视网膜上皮细胞凋亡率升高的同时也伴随着Bax、Caspase-3表达升高和Bcl-2表达下降，研究已证实Bax、Bcl-2、Caspase-3均是miR-21的靶蛋白，视网膜色素上皮细胞凋亡会导致Bax、Caspase-3表达升高和Bcl-2表达下降[16]。本研究结果表明，上调miR-21后，Bax、Caspase-3表达下降，Bcl-2表达升高，与相关研究类似[16]。细胞的增殖与凋亡受众多信号通路调控，PI3K/AKT信号通路就是其中一种，能通过下游多种靶蛋白表达而参与调控细胞生长、凋亡过程。本研究中上调miR-21表达后，PTEN蛋白表达水平显著降低，而p-PI3K、p-AKT表达水平显著升高。提示miR-21过表达通过PTEN/AKT信号通路调控Bax、Caspase-3下降，Bcl-2升高，抑制视网膜色素上皮细胞凋亡进程。

综上所述，上调miR-21可显著抑制H2O2诱导的视网膜色素上皮细胞的凋亡程度，可能通过PTEN/AKT信号通路实现的。但本研究也存在一定不足，相关机制有待进一步探索。