磷酸果糖激酶-2/果糖-2，6-二磷酸酶3在增生型糖尿病性视网膜病变患者玻璃体和血清中的表达及其相关性分析△

唐敏 吕红彬 何跃 欧阳科 周琦 田敏 向小红 曹阳

糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病特异性的眼部微血管并发症之一[1]。病理性新生血管形成是DR从非增生型发展为增生型的关键性事件，当前抑制病理性血管形成的研究主要集中于抗血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，而最新的研究是以阻断内皮细胞糖酵解为中心来抑制新生血管生成。磷酸果糖激酶-2/果糖-2，6-二磷酸酶3(phospofructokinase-2/fructose-2，6-bisphosphatase 3，PFKFB3)是内皮细胞糖酵解过程中的一个限速性调节酶，抑制PFKFB3的表达可使内皮细胞糖酵解速率降低，抑制内皮细胞增殖和迁移，从而减少血管萌芽[2]。本研究通过定量检测增生型DR(proliferative DR,PDR)与非DR患者血清和玻璃体中的PFKFB3及VEGF表达水平，并对比玻璃体内注射抗VEGF药物后相关指标的变化情况，旨在探讨PFKFB3在PDR发生发展中的可能作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料与分组 选取2015年12月5日至2017年1月19日于我科行经睫状体平坦部25G+微创玻璃体切割术的患者62例62眼。试验组纳入标准：确诊为PDR，具备手术指征者。对照组纳入标准：确诊为全层黄斑裂孔(full thickness macular hole，FTMH)及黄斑前膜(preretinal membrane of the macula，PRMM)，并具备手术指征者。以上患者均排除患有自身免疫性疾病、肝脏损害、肺部疾病、精神性疾病及恶性肿瘤等疾病者，严格按照以上纳入和排除标准，最终纳入试验组患者42例(42眼)，其中男24例24眼，女18例18眼，年龄46～71(55.43±9.29)岁，并据患者玻璃体切割术前是否行玻璃体内注射雷珠单抗而进一步分为非注药组和注药组。其中，非注药组16例16眼，男9例9眼，女7例7眼，年龄43～71(54.88±9.46)岁；注药组26例26眼，男15例15眼，女11例11眼，年龄46～69(55.77±9.35)岁；对照组患者20例(20眼)，其中FTMH 14例14眼，PRMM 6例6眼，年龄44～70(53.95±10.21)岁。以上各组年龄构成比差异无统计学意义(P=0.973)，性别构成比差异无统计学意义(P=0.818)。获取标本前获得患者及家属知情同意，并签署知情同意书。所有血清和玻璃体采集均已通过我院伦理审查委员会审查。

1.2 主要仪器及试剂 VX-10Ii眼底照相分析仪(日本，KOWA)、Aviso超声(法国，光太)、光学相干断层成像扫描仪(德国，Zeiss)、25G+微创玻璃体切割机(美国，Bausch Lomb)、手术显微镜(德国，Zeiss)、-80 ℃超低温冰箱(美国，Thermo)、高速离心机(德国，Eppendorf)、微量移液枪(德国，Eppendorf)、水平摇床(美国，Thermo)、酶标仪(美国，Thermo)、PFKFB3和VEGF试剂盒(北京，安迪华泰生物)。

1.3 方法

1.3.1 血清标本采集及保存 各组患者于手术当天清晨抽取空腹肘静脉全血约4 mL，4 ℃静置1 h，以4000 r·min-1离心10 min，取上清，分装后放于-80 ℃ 超低温冰箱中冻存，待测。

1.3.2 玻璃体标本采集及保存 手术开始后建立微创玻璃体切割三通道，切割并收集未经稀释的中央玻璃体，取样后立即注入1.5 mL消毒微量离心管中，在4 ℃条件下，以14 000 r·min-1离心6 min，取上清，分装后放于-80 ℃超低温冰箱中冻存，待测。酶联免疫吸附试验测定各组样本玻璃体及血清中PFKFB3和VEGF表达水平。

1.4 统计学处理 采用SPSS 19.0对数据进行统计分析。计量资料采用均数±标准差表示，两组间采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间有意义的进一步运用LSD法对各组间指标进行两两比较；计数资料采用例数描述，组间比较采用卡方检验。采用Pearson相关性分析对各指标间的相关性进行分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 各组玻璃体、血清中PFKFB3及VEGF表达 试验组患者玻璃体中PFKFB3的水平为(463.17±381.28)ng·L-1，明显高于对照组[(158.43±86.88)ng·L-1](t=4.919，P<0.001)；试验组血清中PFKFB3的水平为(153.45±83.78)ng·L-1，明显高于对照组[(92.72±32.42)ng·L-1](t=4.098，P<0.001)。非注药组患者玻璃体中PFKFB3的水平为(797.29±387.44)ng·L-1，明显高于注药组[(257.56±181.49)ng·L-1](t=5.230，P<0.001)，而非注药组血清中PFKFB3的水平[(164.72±102.57)ng·L-1]与注药组[(146.52±71.18)ng·L-1]差异无统计学意义(t=0.679，P=0.501)。

试验组患者玻璃体中VEGF的水平为(1713.50±1386.90)ng·L-1，明显高于对照组[(205.52±92.93)ng·L-1](t=7.014，P<0.001)；试验组血清中VEGF的水平为(224.98±168.08)ng·L-1，明显高于对照组[(86.80±36.51)ng·L-1](t=5.082，P<0.001)。非注药组患者玻璃体中VEGF的水平为(3399.72±510.06)ng·L-1，明显高于注药组[(675.82±242.57)ng·L-1](t=20.014，P<0.001)，非注药组血清中VEGF的水平为[(373.40±174.23)ng·L-1]，亦明显高于注药组[(133.65±73.10)ng·L-1](t=5.228，P<0.001)。

2.2 各组PFKFB3及VEGF在玻璃体和血清中表达相关性 非注药组、注药组和对照组患者玻璃体与血清中的PFKFB3水平无相关性(非注药组：r=0.194，P=0.471；注药组：r=0.071，P=0.731；对照组：r=0.254，P=0.279)。

非注药组、注药组和对照组患者玻璃体与血清中的VEGF水平均存在正相关关系(非注药组：r=0.952，P<0.001；注药组：r=0.423，P=0.031；对照组：r=0.776，P<0.001)，见图1。

非注药组、注药组和对照组患者玻璃体中PFKFB3与VEGF水平均存在正相关关系(非注药组：r=0.865，P<0.001；注药组：r=0.587，P=0.002；对照组：r=0.807，P<0.001)，而在血清中仅注药组的PFKFB3与VEGF水平存在正相关关系(r=0.444，P=0.023)，非注药组和对照组均无明显相关性(非注药组：r=-0.130，P=0.631；对照组:r=0.045，P=0.849)，见图2。

图1 非注药组、注药组和对照组间玻璃体与血清中VEGF浓度散点图。A：非注药组；B：注药组；C：对照组

图2 非注药组、注药组和对照组PFKFB3与VEGF浓度散点图。A：非注药组(玻璃体中)；B：注药组(玻璃体中)；C：对照组(玻璃体中)；D：注药组(血清中)

3 讨论

PFKFB3是PFKFB家族的一员，被称为人体新陈代谢的“调节器”[3]。在低氧环境、炎症因子或生长因子的刺激下，PFKFB3表达增多，可明显提升糖酵解速率[3-4]。研究发现，内皮细胞出芽和分裂所需的80%以上能量供应是来自于糖酵解而非氧化代谢[5-6]，并且在内皮细胞迁移和增殖时，其糖分解速率将会提高2倍[5]。因此，内皮细胞的糖酵解途径可能成为调节新生血管形成的一个潜在作用靶点，而PFKFB3作为内皮细胞糖代谢中的重要调节酶，其在新生血管的形成过程中发挥着至关重要的作用。

本研究结果显示，试验组患者玻璃体和血清中PFKFB3的表达均明显高于对照组，提示PFKFB3可能参与了PDR的发生发展。DR中视网膜缺血缺氧是促进新生血管形成的最强刺激因素，Xu等[7]将脐静脉内皮细胞置于低氧环境下(氧体积分数为0.5%)，其PFKFB3 mRNA及蛋白表达水平明显上调，表明缺血缺氧条件下，视网膜血管内皮细胞的PFKFB3表达明显增高。本研究中，试验组和对照组玻璃体与血清中PFKFB3含量无相关性，这表明PDR患者玻璃体内相对高浓度的PFKFB3可能来源于局部眼内组织，如视网膜血管内皮细胞等的高表达。PFKFB3作为糖酵解过程中的关键酶，主要在细胞内发挥作用。高糖作用下的视网膜血管内皮细胞处于病理状态，内皮细胞凋亡增加，使得局部玻璃体中可检测到浓度相对较高的PFKFB3。

VEGF是目前研究最多、作用最明确的促血管生成因子。王欢等[8]研究发现，PDR组玻璃体VEGF含量较黄斑裂孔组、正常对照组均明显升高。Sydorova 等[9]研究表明，PDR组患者血清和玻璃体中VEGF含量均高于增生型玻璃体视网膜病变(proliferative vitreous retinopathy，PVR)组和对照组，而PVR组患者仅在血清中VEGF含量升高，提示PDR患者眼内组织大量合成VEGF参与PDR发生发展过程。本研究发现，试验组和对照组玻璃体与血清中VEGF具有显著相关性，这一结果与Baharivand等[10]研究一致，即PDR组患者血清和玻璃体中VEGF含量均高于对照组，而且血清与玻璃体中VEGF含量具有显著相关性。

玻璃体内注射抗VEGF抗体是目前公认治疗PDR的有效方法，本研究结果显示，非注药组玻璃体和血清中浓度水平均明显高于注药组，这与Ma等[11]的研究结果一致。眼内注射抗VEGF抗体可直接结合玻璃体内的游离VEGF从而使测得的VEGF浓度大大下降。单俊杰等[12]研究显示，PDR患者玻璃内注射贝伐单抗后所有样本血清中VEGF含量均降低，且在术后7 d达最大降幅，术后28 d VEGF有所上升，但仍未达术前水平，这表明局部注射的抗VEGF抗体可到达血液循环从而引起血清VEGF水平的下降。

在血管生成过程中，内皮细胞的运动和活性受多种基因、分子信号及代谢途径共同调控，其中包括VEGF和PFKFB3[13-15]。Xu等[7]研究发现，VEGF可促进PFKFB3的表达，且VEGF同时在转录水平及转录后水平对PFKFB3进行调控。另外，PFKFB3抑制剂可以扩大阻断VEGF的效应。因此，VEGF可能是PFKFB3的上游信号分子，它们相互作用共同调节血管新生过程。本研究结果显示，非注药组玻璃体中PFKFB3含量明显高于注药组，与两组间玻璃体中VEGF含量变化趋势一致，且PFKFB3含量与VEGF含量具有显著相关性。而各组间血清中仅注药组PFKFB3与VEGF含量变化具有相关性，这可能是因为使用抗VEGF药物减少VEGF与VEGF受体的结合，减弱VEGF对PKFKB3表达的上调作用，而血清中VEGF的浓度下降并未引起血清PFKFB3表达水平的改变，其原因可能是由于局部玻璃体内注射的抗VEGF药物经血循环进入全身的量不足以引起PFKFB3表达量的改变。加之PFKFB3作为糖酵解过程中的关键酶，其主要在细胞内发挥作用，而在血清中可检测的量是十分有限的。

目前，有关于PFKFB3在DR中作用的研究尚十分有限，但从迄今已有的研究来看，通过抑制PFKFB3而减少病理性新生血管形成来在延缓DR可能成为有效的治疗策略。