错配修复基因MSH3在人晶状体中的表达△

闫露露 张天晓 冷云吉 罗阳 张劲松 曹丽华

年龄相关性白内障(age-related cataract,ARC)又称为老年性白内障，主要发生于中老年人群，是导致老年人弱视和失明的主要疾病。在世界范围内，半数以上的失明是由ARC造成的。ARC的发病机制虽然尚不明确，但氧化应激导致的DNA损伤是白内障发生公认的诱因之一[1]。近年来，越来越多的研究表明，DNA修复基因参与白内障的发生发展，ARC患者晶状体上皮细胞往往存在更多的染色体异常和DNA损伤现象，与之相关的DNA修复基因MSH2、MSH3、XRCC6等表达降低[2]。MSH3属于DNA错配修复(mismatch repair,MMR)家族成员，与MSH2形成异源二聚体MutSβ，在DNA双链断裂修复和错配修复中发挥重要作用[3]。为探讨DNA错配修复基因与ARC的相关性，本研究通过RT-PCR和免疫荧光技术，检测DNA错配修复基因MSH3在晶状体上皮细胞中的表达情况，并以此探讨MSH3的表达变化可能对晶状体发育过程的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 本研究所用健康人的脐带由沈阳市菁华医院提供，ARC患者的晶状体组织和24周人胎眼的石蜡切片由中国医科大学附属第四医院提供。所有材料均通过医院伦理委员会审核，并得到患者或家属的知情同意，实验所用永生化人晶状体上皮细胞系SRA01/04由中国医学科学院基础医学遗传教研室提供。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将冻存SRA01/04细胞的冷冻管从液氮罐中取出，立即放入37 ℃水浴锅中快速解冻，1000 r·min-1离心，去上清，加入含体积分数10%胎牛血清的MEM-NESS培养基，吹打混匀后移入培养瓶中，置于37 ℃、含体积分数5%CO2的培养箱中培养48 h用于RT-PCR检测。

1.2.2 RT-PCR检测 按照Trizol试剂说明书步骤提取健康人脐带、ARC患者的晶状体组织以及SRA01/04细胞中的总RNA并测定浓度。使用TAKARA公司的逆转录试剂盒逆转录成cDNA后，以GAPDH为内参，在Thermal cycler TP600 PCR仪中行RT-PCR检测MSH3的表达。反应条件为94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火及延伸30 s；共35个循环，实验重复3次。MSH3引物：上游引物为5’-GCAAAAGGATATAAGGTGGGAGT-3’，下游引物为5’-ATAAAGGGCAGTCAATTTCCGG-3’。GAPDH引物：上游引物为5’-TGTTGCCATCAATGACCCCTT-3’，下游引物为5’-TCCACGACGTACTCAGCG-3’。RNA提取试剂Trizol购自美国Invitrogen公司，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2.3 免疫荧光检测 将24周人胎眼石蜡切片置于二甲苯(I)、二甲苯(II)中各8 min进行脱蜡处理，再依次置于体积分数100%、95%、90%、80%和70%的梯度酒精中浸泡5 min，PBS洗3次(每500 mL PBS加入2 mL Tween 20)，每次5 min。加一滴抗原修复液室温修复10 min。随后使用体积分数5%的驴血清封闭40 min。一抗孵育：加入70 μL MSH3(A-17)(抗体1:200稀释，体积分数5%驴血清作为稀释液)于湿盒中4 ℃过夜。第2天PBS洗3次后加入70 μL驴抗鼠IgG H&L(1:150稀释)避光孵育45 min，PBS洗3次后DAPI(1 mg·L-1)染核5 min，PBS洗3次，封片，置于活细胞工作站倒置荧光显微镜下观察MSH3的表达和定位情况并拍照。

2 结果

2.1 RT-PCR检测晶状体上皮细胞中MSH3基因的表达 以健康人脐带、ARC患者的晶状体组织以及SRA01/04细胞的cDNA为模板，PCR扩增MSH3基因，结果表明，MSH3在健康人脐带(阳性对照)、晶状体上皮细胞系SRA01/04中高表达，在ARC患者晶状体组织中表达下调(图1)。

图1 RT-PCR检测MSH3基因的表达。1、4：健康人脐带；2、5：ARC患者晶状体组织；3、6：晶状体上皮细胞系SRA01/04

2.2 免疫荧光检测24周人胎眼晶状体组织中MSH3蛋白的表达情况 免疫荧光检测结果表明，MSH3蛋白在24周人胎眼晶状体纤维细胞、晶状体上皮细胞以及晶状体前囊组织中均有表达，且在晶状体上皮细胞中高表达(图2)。

图2 MSH3蛋白在24周人胎眼晶状体组织中的表达情况(红色箭头指示晶状体上皮细胞)。A：DAPI；B：MSH3；C：Merge

3 讨论

随着我国人口老龄化进程的加快，ARC患者的人数也随之增多。ARC是造成老年人弱视和失明的重要原因，视力障碍给患者、家庭和社会带来极大的不便和负担。因此，对ARC的预防以及致病机制的研究尤为重要。

ARC的发病机制比较复杂，是多种因素对晶状体长期作用的结果。随着对ARC发病机制的深入研究。越来越多的研究发现，与白内障发生密切相关的因素主要为晶状体的氧化损伤、紫外线照射、晶状体中钙离子浓度升高等。其中氧化应激导致的DNA损伤不仅会使晶状体上皮细胞凋亡，还会导致晶状体中蛋白质的表达异常，是白内障发生的主要诱因[4-5]。与此同时，晶状体内也存在抗氧化损伤修复系统，两者存在动态平衡，共同维持晶状体内相关细胞的正常生理状态。任何一个环节发生异常均可能引起晶状体的损伤，进而导致白内障的发生[6-7]。

MMR系统广泛存在于生物体中，主要包括6个成员：MSH2、MSH3、MSH6、MLH1、MLH3和PMS1。MMR系统不仅可以通过纠正DNA双螺旋上错配的碱基对保持基因组的稳定性和完整性，还可以诱导DNA损伤细胞的凋亡，消除有突变细胞生长形成的癌变。一旦MMR系统相关的修复基因功能发生失调，则会引起DNA修复障碍，导致微卫星的不稳定性，从而诱发癌症的发生[8]。近年来，关于DNA修复基因参与ARC发生发展的研究越来越受到研究者的关注。国外有研究表明，ARC的形成与DNA修复基因OGG1的甲基化和低表达相关，并且OGG1在DNA修复BER通路中起着重要作用[9]。ARC的发病风险与DNA损伤修复基因MTHFR、XPD和XRCC1等基因的多态性相关[10-12]。DNA修复基因ERCC6参与紫外线介导的DNA损伤修复，在核型ARC患者晶状体上皮细胞中ERCC6表达降低[13]。国内也有研究发现，DNA修复基因存在于不同的通路中，ARC患者及正常对照晶状体皮质和上皮细胞中的部分DNA修复基因的表达存在差异[6]。总之，以上研究均表明，DNA修复基因在ARC的形成过程中起着重要作用，并且修复过程需要多种酶、多种通路共同参与以确保DNA的稳定性，维持晶状体的透明性。

本研究通过RT-PCR及免疫荧光检测发现，MSH3在晶状体上皮细胞系SRA01/04中高表达，在ARC患者晶状体组织中表达下调，且MSH3在24周人胎眼晶状体纤维细胞、晶状体上皮细胞以及晶状体前囊组织中均有表达，尤其在晶状体上皮细胞中高表达。这些结果均支持MSH3基因可能会影响DNA的错配修复过程，影响晶状体发育，进而导致ARC的发生，其具体的分子机制还有待于后续的研究。