川芎嗪对过氧化氢致大鼠视网膜神经节细胞氧化损伤的抑制作用及机制△

孙旋 冯卓蕾 陈娜

糖尿病视网膜病变严重影响视力，糖尿病患者机体长期处于高血糖状态会引起视网膜结构及功能改变，进而导致视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell，RGC)氧化应激损伤[1]。如何寻找有效的药物来延缓或减少视神经损伤是目前研究的热门话题。川芎嗪化学名为四甲基吡嗪，是一种具有改善微循环、抗炎、抗氧自由基和抑制细胞凋亡作用的中药提取物[2-3]。本研究旨在探讨川芎嗪对RGC-5细胞凋亡的抑制作用，以期为糖尿病视网膜病变的治疗开辟新方向。

1 材料与方法

1.1 材料 川芎嗪(北京制药工业研究所)，大鼠RGC-5细胞(中国科学院上海生命科学研究院细胞库)，DMEM(江苏凯基生物工程公司)，MTT试剂盒(上海伯奥生物制品公司)，H2DCFDA染色试剂盒(上海碧云天公司)，Hoechst-PI双染试剂盒(南京建成生物研究所)，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)及丙二醛(malondialdehyde,MDA)试剂盒(上海碧云天公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 在DMEM培养基中培养RGC-5细胞(含体积分数10%胎牛血清、体积分数5%CO2及双抗，温度为37 ℃；每天观察细胞的生长状态，2～3 d换液1次。

1.2.2 药物处理及实验分组 将细胞分成5组：(1) 正常对照组：不做任何处理；(2) 阴性对照组：用20 g·L-1川芎嗪孵育24 h；(3) 氧化损伤组：用100 μmol·L-1的H2O2孵育24 h；(4)川芎嗪低浓度组：用20 g·L-1川芎嗪孵育24 h后加入100 μmol·L-1的H2O2孵育12 h；(5)川芎嗪高浓度组：用40 g·L-1川芎嗪孵育24 h后加入100 μmol·L-1的H2O2孵育12 h。

1.2.3 MTT法测定细胞增殖情况 取对数生长期的RGC-5细胞接种于96孔板中，调节细胞密度为10×109个·L-1，每孔200 μL，向各孔细胞中加入10 μL MTT(5 g·L-1)，4 h 后吸出上清液，加入100 μL DMSO溶液，低速振荡10 min后检测各孔570 nm的吸光度(A)值。

1.2.4 荧光标记法检测RGC-5细胞内活性氧含量 取5 μL H2DCFDA染料处理各组细胞，避光反应15 min后通过荧光显微镜在490 nm激发光处可检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量。

1.2.5 Hoechst-PI染色观察细胞凋亡情况 细胞经相应处理后用磷酸盐缓冲液洗涤细胞两次，在150 μL 的Binding Buffer中加入2 μL Hoechst-PI染液，避光反应5 min后，在荧光显微镜下观察结果并拍照。

1.2.6 SOD、GSH-Px及MDA含量检测 用1 g·L-1胰蛋白酶消化各组细胞，1200 r·min-1离心机离心10 min，收集细胞并用磷酸盐缓冲液冲洗2次，加入30 μL细胞裂解液后冰上孵育20 min，10 000 r·min-1离心10 min，按试剂盒说明书，使用721D分光光度计测定细胞内SOD、GSH-Px及MDA含量。

2 结果

2.1 不同浓度川芎嗪对H2O2致RGC-5细胞氧化损伤的影响 MTT法测定结果显示，正常对照组与阴性对照组RGC-5细胞活性分别为96.67%±4.33%和98.33%±3.56%，两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。氧化损伤组RGC-5细胞活性(24.67%±2.90%)明显下降，与阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。与氧化损伤组比较，川芎嗪低、高浓度组RGC-5细胞活性分别提高到 51.33%±4.35%和60.00%±3.65%，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。

2.2 各组RGC-5细胞内ROS变化 采用荧光标记法检测RGC-5细胞内ROS变化情况，亮绿色高荧光代表氧化损伤细胞。正常对照组与阴性对照组细胞内ROS表达均较低，氧化损伤组DCF荧光信号明显增强，不同浓度川芎嗪干预后，荧光信号强度逐渐减弱(图1)。

2.3 各组RGC-5细胞凋亡情况 Hoechst-PI染色显示未发生凋亡反应的细胞核为均匀一致的暗蓝色低荧光，凋亡细胞为亮蓝色荧光，坏死细胞为红色荧光。荧光显微镜下可见氧化损伤组凋亡细胞数增多，甚至出现红染的坏死细胞，细胞凋亡率为66.00%±2.98%；川芎嗪干预后，凋亡及坏死细胞逐渐减少，川芎嗪低、高浓度组细胞凋亡率分别为52.33%±4.11%和46.04%±3.52%，两组细胞凋亡率与氧化损伤组比较差异均有统计学意义(均为P<0.05)。见图2。

图1 各组RGC-5细胞内ROS改变。A：正常对照组；B：阴性对照组；C：氧化损伤组；D：川芎嗪低浓度组；E：川芎嗪高浓度组

图2 川芎嗪对RGC-5细胞凋亡的影响。A：正常对照组；B：阴性对照组；C：氧化损伤组；D：川芎嗪低浓度组；E：川芎嗪高浓度组

2.4 各组RGC-5细胞内SOD、GSH-PX及MDA含量的变化 正常对照组与阴性对照组RGC-5细胞内SOD、GSH-PX及MDA含量比较，差异均无统计学意义(均为P>0.05)；与阴性对照组比较，氧化损伤组RGC-5细胞内SOD、GSH-PX含量明显下降，MDA含量升高，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。与氧化损伤组比较，川芎嗪高浓度组SOD、GSH-PX含量升高，MDA含量下降，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。与氧化损伤组比较，川芎嗪低浓度组SOD与MDA含量变化不大(均为P>0.05)，GSH-PX含量升高(P<0.05)。见表1。

表1 各组RGC-5细胞内SOD、GSH-PX及MDA含量的变化

组别SOD/U·mL-1GSH-PX/U·mL-1MDA/nmol·mL-1正常对照组75.76±3.65155.96±4.2557.89±3.17阴性对照组74.44±3.37153.74±4.5355.44±3.58 氧化损伤组46.94±4.27a102.25±4.89a90.46±3.55a川芎嗪低浓度组50.68±3.84126.25±3.44b86.74±3.18 川芎嗪高浓度组68.73±3.00b140.35±4.31b78.29±4.13b

注：与阴性对照组比较，aP<0.05;与氧化损伤组比较，bP<0.05

3 讨论

RGC细胞的轴索构成视神经纤维，是位于视网膜末端的神经细胞，正常人视网膜中大约有150万个神经节细胞。RGC细胞的变性、损伤和凋亡常引起视觉功能障碍，是高眼压性青光眼、视神经萎缩、视网膜中央动脉阻塞、视网膜色素变性、糖尿病视网膜病变等许多视网膜和视神经疾病发展的最终结果[4-5]。因此，有效保护RGC细胞对上述疾病患者维持视力至关重要。

糖尿病患者体内离子及碳水化合物代谢紊乱，长期高糖状态破坏视网膜血管内皮细胞功能，引起糖尿病微血管并发症[6]。为了深入研究糖尿病视网膜病变的发生机制并探索出有效的治疗药物，国内外学者尝试了大量方法诱导RGC-5细胞凋亡，例如：高糖、化学药物、H2O2等[7-8]。为了能更接近人体环境，我们模拟糖尿病患者体内环境中RGC-5细胞的氧化应激状态，利用100 μmol·L-1H2O2建立细胞氧化损伤模型，观察川芎嗪对RGC-5细胞的保护作用。

临床上，川芎嗪已被用来治疗多种眼部疾病：青光眼、慢性缺血性视网膜病变、视网膜中央静脉阻塞、糖尿病视网膜病变等[9]。研究证实，川芎嗪可以通过血-视网膜屏障进入视网膜组织，能确保药物在眼部的有效浓度[10]。国内学者黄焱等[11]发现，给予糖尿病模型大鼠川芎嗪(每天100 mg·kg-1) 灌胃后，大鼠视网膜组织中一氧化氮合酶和醛糖还原酶的活性明显下降,证实了川芎嗪对糖尿病大鼠视网膜组织具有保护作用。

本研究分别采用20 g·L-1、40 g·L-1的川芎嗪处理人RGC-5细胞24 h，发现川芎嗪能够有效抑制RGC-5细胞氧化损伤，随着川芎嗪浓度增加，RGC-5细胞增殖率逐渐增加，凋亡率逐渐降低，表明川芎嗪能够抑制RGC-5细胞凋亡反应的发生，并且与药物浓度相关。

SOD、GSH-PX及MDA是机体内主要的抗氧化酶，其中，MDA含量高低可反映细胞内自由基水平，SOD、GSH-PX与自由基清除能力正相关[12]。在本研究中，川芎嗪作用于RGC-5细胞后，SOD、GSH-PX表达相对于氧化损伤组均增高，MDA表达降低，提示川芎嗪通过改变抗氧化酶表达抑制了RGC-5细胞凋亡。

综上所述，川芎嗪有望成为治疗糖尿病视网膜病变的有效药物，本研究为该病的临床治疗提供新思路。