60Co-γ射线对不同品种澳洲坚果萌动种子的诱变效应

柳 觐，倪书邦，孔广红，吴 超，贺熙勇

(云南省热带作物科学研究所，云南 景洪 666100)

【研究意义】澳洲坚果(Macadamiaspp.)又名昆士兰栗、澳洲胡桃，为山龙眼科(Proteaceae)澳洲坚果属(Macadamia)常绿乔木，原产于澳大利亚，但大规模商业化种植始于夏威夷，因此又称夏威夷果，其大规模种植历史仅有数十年，是一种新兴的高档坚果。澳洲坚果果仁口感酥脆，富含多种不饱和脂肪酸和人体必需的氨基酸、微量元素和维生素[1-2]，长期食用有助于降低心血管疾病的发生率[3-4]。目前澳洲坚果种植范围包括美国、澳大利亚、肯尼亚、南非、中国、东南亚等国家和区域，中国自20世纪70年代末开始澳洲坚果的引种试种，现已成为世界上澳洲坚果种植面积最大的国家，而云南省则是中国澳洲坚果的主产区[5]。当前云南省推广种植的澳洲坚果品种均从国外引进，由于品种选育地与云南种植区的气候环境差别较大，致使大多数品种的产量等田间表现远不及其原始选育地[6-7]，并且近年国外引种愈加困难，优良品种的匮乏已严重制约了中国澳洲坚果产业的发展，因此，必须培育出适合中国种植环境的澳洲坚果优良品种。因为澳洲坚果是外来物种，国内没有多样化的野生种质资源可供选种利用。因此，利用人工诱变方式增加现有种质资源的变异率，得到具有某种优异性状的突变体植株，进而将其选育成为产量、品质或抗性表现较好品种，是澳洲坚果品种选育的一个有效途径。目前常用的诱变方式主要包括EMS诱导[8]、离子注入[9]、磁场处理[10]、太空诱变[11]和γ射线辐照等，其中60Co-γ射线辐照诱变应用最为广泛，在诸多粮食作物和园艺作物上应用并取得了一系列成效。【前人研究进展】在澳洲坚果辐照萌动种子诱变育种方面，国内外尚未见报道。近年来本研究组以澳洲坚果干种子[12]、接穗[13]等为诱变材料，采用60Co-γ射线辐照的方式开展了诱变育种，并对不同试验材料的诱变效应进行了较为系统的研究。【本研究切入点】但萌动种子与干种子不同，萌动种子的胚组织有丝分裂旺盛，细胞内进行着大量的遗传物质的复制，对60Co-γ射线辐照更敏感，基因突变的频率也更高。以澳洲坚果主栽品种云澳57、云澳51、云澳41、云澳58的萌动种子为材料，采用不同剂量60Co-γ辐照的方式进行诱变处理，对诱变后代的萌发和生长情况进行了观测，以期建立澳洲坚果60Co-γ的辐照诱变育种的系统方法。【拟解决的关键问题】探明不同品种对60Co-γ的辐照诱变的致死剂量和半致死剂量，创制出遗传意义上全新的澳洲坚果新种质，丰富澳洲坚果种质资源，为新品种选育奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

采集云澳57、云澳51、云澳41、云澳58共4个澳洲坚果品种的成熟种子，人工脱皮后将壳果置于经多菌灵灭菌后的沙床催芽，每天洒水2次以保持沙床湿润。播种1周后将上部的细沙小心刨去，将壳果洒水冲洗后挑出果壳开裂1 mm以上但芽点尚未突出果壳的萌动种子作为实验材料。

1.2 试验方法

1.2.160Co-γ射线辐照及致死剂量确定 将上述萌动种子用剂量为10、25、40、55、70、85、100、115、130的60Co-γ射线进行辐照处理，剂量率为10 Gy/h，每个剂量3次重复，以同一批催芽裂壳但未经辐照的萌动种子为对照。将辐照后的萌动种子继续置于沙床催芽，每周调查发芽率1次，通过与对照比较，确定不同品种萌动种子的致死剂量和半致死剂量。

1.2.2 诱变苗观测及突变体种质筛选 对经不同剂量60Co-γ射线辐照后诱变苗的叶长、叶宽、茎长、茎粗等性状参数进行测定。待第2轮真叶长定后，将诱变苗移栽至营养袋，待苗高60 cm进行大田定植并持续跟踪观测，定植株行距为2 m×4 m，每年观测2次，重点观测茎干生长量、树形、叶形、分枝和开花情况。

1.3 统计方法

试验数据采用SPSS16.0软件进行统计分析；采用Microsoft Office Excel 2013软件进行作图。

2 结果与分析

2.1 60Co-γ射线辐照对不同品种澳洲坚果萌动种子发芽的影响

对供试4个品种的萌动种子经不同剂量60Co-γ射线辐照后的发芽势和发芽率进行调查发现(图1～4)，60Co-γ射线辐照对各品种澳洲坚果萌动种子的发芽势均有明显的抑制效应。辐照剂量越高，萌动种子的发芽时间越晚、发芽速率越慢、发芽率越低。以品种云澳57为例，对照和经10、25 Gy处理后的萌动种子从第2周开始发芽；经40 Gy处理后从第3周开始发芽；经55、70、85 Gy处理后从第4周开始发芽；经100 Gy处理后从第5周开始发芽；经115 Gy处理后从第6周开始发芽；经130 Gy处理后的萌动种子则没有发芽。品种云澳41无论是否是辐照后的萌动种子，发芽时间均要比其他3个品种晚。

2.2 60Co-γ射线辐照对不同品种的致死剂量和半致死剂量

发芽率调查发现，各品种未经辐照的萌动种子在第6～8周均已全部发芽或发芽率已稳定；8周后将沙床中未发芽的萌动种子刨出观测发现，所有未发芽种子的芽点已变褐甚至腐烂，已无后续发芽可能；因此以辐照后第8周的发芽率代表各处理的最终发芽率，对不同品种经不同剂量60Co-γ射线辐照后的发芽率进行了回归分析，如图5～8所示。

供试品种云澳57、云澳51、云澳41、云澳58的辐照剂量(x，Gy)与发芽率(y， %)间的回归关系分别为：y=0.0011x2- 0.9727x+106.26(R2=0.9839)；y=-0.0024x2-0.4576x+103.50(R2=0.9884)；y=-0.0051x2-0.2233x+101.70(R2=0.9281)；y=0.0012x2-1.0402x+105.89(R2=0.9678)。由此回归方程推算，云澳57、云澳51、云澳41、云澳58对剂量率为10 Gy的60Co-γ射线辐照的半致死剂量分别为62.22、81.81、81.14、57.55 Gy，致死剂量分别为127.67、133.17、121.01、117.81 Gy，说明不同品种澳洲坚果萌动种子对60Co-γ射线辐照的敏感性存在差异，其中以云澳51最耐受，而云澳58最敏感。

图1 60Co-γ射线辐照对云澳57萌动种子发芽的影响Fig.1 The irradiation effects of 60Co-γ ray on seed germination of YunMac 57

图2 60Co-γ射线辐照对云澳51萌动种子发芽的影响Fig.2 The irradiation effects of 60Co-γ ray on seed germination of YunMac 51

图3 60Co-γ射线辐照对云澳41萌动种子发芽的影响Fig.3 The irradiation effects of 60Co-γ ray on seed germination of YunMac 41

2.3 60Co-γ射线辐照萌动种子对幼苗形态的影响

对不同品种萌动种子经60Co-γ射线诱变处理后幼苗的形态观测发现，随着辐照剂量的增高，植株的变异率也明显增大。与对照相比，几乎所有经辐照的诱变苗都出现了植株矮化和茎干增粗的现象，究其原因与60Co-γ射线辐照使萌动种子的芽点受到抑制有关。以品种云澳57为例，最为常见的变异现象是分叉增多，一粒萌动种子或出现双根、或出现双茎、甚至同时出现双根和双茎(图9-A)；部分诱变苗表现出须根减少(图9-B)，或主根变短须根增多的现象(图9-C)。

图4 60Co-γ射线辐照对云澳58萌动种子发芽的影响Fig.4 The irradiation effects of 60Co-γ ray on seed germination of YunMac 58

图5 品种云澳57萌动种子发芽率与60Co-γ射线辐照剂量的回归分析Fig.5 Regression analysis of seed germination rate of YunMac 57 and irradiation dose of 60Co-γ

图6 品种云澳51萌动种子发芽率与60Co-γ射线辐照剂量的回归分析Fig.6 Regression analysis of seed germination rate of YunMac 51 and irradiation dose of 60Co-γ

图7 品种云澳41萌动种子发芽率与60Co-γ射线辐照剂量的回归分析Fig.7 Regression analysis of seed germination rate of YunMac 41 and irradiation dose of 60Co-γ

图8 品种云澳58萌动种子发芽率与60Co-γ射线辐照剂量的回归分析Fig.8 Regression analysis of seed germination rate of YunMac 58 and irradiation dose of 60Co-γ

3 讨 论

诱变育种是拓宽澳洲坚果种质资源遗传基础、提高种质资源遗传多样性，创制新种质的重要手段。采用澳洲坚果萌动种子作为诱变材料，萌动种子中的细胞有丝分裂旺盛、遗传物质的复制和转录非常活跃，遗传物质更易受到射线辐照的影响发生突变。与前期研究相比[12]，同一品种萌动种子的致死剂量、半致死剂量明显小于干种子，说明其对60Co-γ射线辐照更为敏感，更易于获得突变体植株。

经10和25 Gy的低剂量60Co-γ射线辐照后，品种云澳57、云澳51和云澳41在部分时间段的发芽率甚至要高于对照(CK)，这与前人的研究相一致。此外，无论是否经过辐照，品种云澳41开始发芽的时间均要比其他3个品种晚，发芽率前期增长较慢，5周后才开始快速增长，究其原因与其品种特性有关。不同品种萌动种子对60Co-γ射线辐照的耐受性不同，4个供试品种的耐受性依次为云澳51>云澳41>云澳57>云澳58。

A：出现双根、或出现双茎、或同时出现双根和双茎；B：须根减少；C：主根变短须根增多A: One seedling with double root, or double stem, and double root and double stem at the same time; B: Decrease of the fibrous root; C: Shorter taproot with the increase of fibrous root图9 云澳57的幼苗变异情况Fig.9 The seedling mutant of macadamia cultivar YunMac 57

半致死剂量(Lethal Dose 50，LD50)是作物诱变育种的重要参数，多数研究者认为，半致死剂量可作为作物诱变育种的最适宜诱变剂量。经半致死剂量诱变处理后，既能保证一定数量的成活率，又可达到较高的诱变几率。经不同品种间的比对和重复试验，发现澳洲坚果萌动种子的半致死剂量为57.55～81.81 Gy，这提示在后续的以萌动种子为材料的60Co-γ射线诱变育种实践中，可参照此区间的辐照剂量进行诱变处理。

通过研究，已初步筛选出了一批在形态性状上与对照有明显差异的疑似突变体植株，并在大田中进行了定植和跟踪观测，但其开花、结果等农艺性状还有待研究。

4 结 论

澳洲坚果不同品种萌动种子对60Co-γ射线辐照的耐受性不同，澳洲坚果萌动种子的60Co-γ射线适宜诱变剂量为57.55～81.81 Gy。