不同纳米氧化铁对小麦幼苗生理特性的影响

李俊丽，邹正康，刘 倩，陆芹洪，杨道勇

(武汉理工大学化学化工与生命科学学院生物系，湖北 武汉 430070)

【研究意义】铁是植物生长发育过程中不可缺少的元素之一，它参与叶绿素的合成，影响光合作用的氧化还原系统，植物一旦缺少铁就会出现叶片黄化等问题。植物体内有着一套完整的吸收、转运和利用铁的机制[1]。土壤中的铁含量很高，但是可以被植物吸收利用的铁较少[2]。在农业生产中，常常通过外源添加铁肥来改善植物缺铁的状况[3]。然而，在施加传统铁肥时，铁离子易与土壤中的物质结合为难溶化合物，同时Fe2+也易转化为Fe3+而失效，不易被植物吸收[4]，因此找一个合适的补铁材料已经迫在眉睫。【前人研究进展】纳米材料是指在三维空间中至少有一维处于纳米尺寸(0.1～100 nm)或由它们作为基本单元构成的材料。纳米材料相比于普通块体材料有着独特的微小结构和特异的性能，如小尺寸效应、表面与界面效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应等[5]。纳米材料作为一种新型材料，由于其优异的理化性质而在很多领域得到广泛应用[6-9]。在农业生产中，由于大量施用化学肥料，出现肥料利用率低、导致水体污染、臭氧层破坏和加剧温室效应等环境问题。因此，合理、高效施用化肥，提高肥料利用效率，成为当前急需解决的重要问题。目前已有较多研究将纳米添加剂、纳米增效剂应用到肥料中，研究其对作物生长的影响。纳米氧化铁是目前研究和应用最为广泛的纳米材料之一，具有许多新性能，如较大的比表面积，超顺磁性以及固有的生物相容性等，因此广泛应用于医疗诊断、药物控释、分离技术以及环境工程等领域。之前已有研究报道过不同纳米氧化铁对植物的积极作用[10-12]，也有研究发现纳米氧化铁对植物产生了毒害作用。由于目前纳米氧化铁对植物幼苗生长发育的效果不一，因此还需开展大量相关实验，以阐明其机制。【本研究切入点】本文通过对不同纳米氧化铁处理的小麦幼苗的各项生理指标的测定，探讨了不同种类纳米氧化铁对小麦幼苗生长发育的影响。【拟解决的关键问题】小麦是三大谷物之一，是一种常见的农作物，仅2017年中国河南省小麦的产量就高达3550万t[13]。由于小麦在世界各地的广泛种植，以及其重大的食用价值，本试验选用小麦作为研究对象，探究适宜浓度的三种不同纳米氧化铁(α-Fe2O3、γ-Fe2O3、Fe3O4)和铁离子(Fe2+、Fe3+)处理下植物的抗氧化酶体系、细胞膜脂质过氧化程度以及叶绿素、根系活力等生理生化指标的影响。为评估纳米氧化铁对作物生长发育的影响及其作为铁肥在农业上使用提供一定的理论依据和数据基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试小麦为河南新乡的豫农小麦新麦18号，纳米材料购自于麦克林公司。选取籽粒饱满、无病虫害、无损坏、大小均一的小麦种子约600颗用于试验。

1.2 试验方法

小麦种子经5 %次氯酸钠溶液(v∶v)消毒10 min后用去离子水浸泡4 h。浸泡后用纱布包裹，于30 ℃的暗箱中催芽48 h。将长势良好的幼苗于滤纸上见光培养72 h。随后选取长势均匀的幼苗移入水培盆中，于培养箱中培养。在移入水培盆4 d(去离子水和1/4缺铁改良霍格兰培养液培养各2 d)后，进行试验处理，将试验分为7个处理组，每组40株幼苗，此外每个处理组都进行3次重复试验。将幼苗分别用浓度为50 mg/L(以Fe元素浓度计)的纳米α-Fe2O3、γ-Fe2O3、Fe3O4、FeSO4·7H2O、FeCl3·6H2O、加铁改良霍格兰培养液(normal)和缺铁改良霍格兰培养液(CK)处理1周,随后将所有幼苗同一位置的叶片及所有根系取0.3 g分别剪切并研磨，作为酶液进行实验检测，每个指标均有3个平行组。其中，设置Fe2+、Fe3+处理组是为了研究离子的植物毒害作用，Fe(II)-EDTA是常用的螯合铁肥，在这里作为阳性对照，在实验室预实验的基础上，选用了50 mg/L这个促进植物生长的最适浓度。在处理前，纳米粒子均在去离子水中进行超声分散，直至得到混合均匀的悬浮液。培养时光照强度为20 000 lx，光/暗周期设置为28 ℃、16 h/18 ℃、8 h，每3 h通气30 min。

1.3 生理生化指标的测定

1.3.1 生理指标的测量 根的长度使用直尺测量；丙二醛(MDA)含量使用硫代巴比妥酸法进行检测[14]；超氧化物歧化酶(SOD)活性使用四氮唑蓝法进行检测[15]；过氧化氢酶(CAT)活性使用紫外吸收法进行检测[16]；过氧化物酶(POD)活性使用愈创木酚法[17]进行检测；小麦的根系活力使用甲醇浸泡TTC法进行检测[18]；可溶性糖含量使用蒽酮-硫酸比色法进行检测[19]；可溶性蛋白含量使用考马斯亮蓝法进行检测[20]；花青素含量使用盐酸乙醇浸提法进行检测[21]；叶绿素含量使用乙醇浸提法进行检测[22]。实验中所选用样品都经超声处理以洗去表面吸附物。

1.3.2 根和叶中Fe含量分析 选取处理后长势均匀的小麦幼苗，在超声清洗器(KQ2200B，100 W，40 kHz，昆山市超声仪器有限公司)中超声10 s以洗净幼苗表面吸附物质，然后，置于60 ℃烘48 h。取100 mg烘干的根或叶分别置于3 mL浓硝酸中于100 ℃金属浴中消解2 h。待冷却至室温后，向其中加入0.5 mL 30 % H2O2，100 ℃消解0.5 h。铁含量通过原子吸收分光光度计测定。

1.4 统计分析

实验中每个处理都进行了3次重复，结果表示为“平均值±标准偏差”。实验数据使用IBM SPSS Statistics 22进行了Duncan多重比较(P≤0.05)进行统计分析。最后使用origin7.5作图。

2 结果与分析

2.1 小麦叶绿素含量及铁分布情况

对于植物地上部来讲，叶绿素是一个判断植物生长发育状况的重要指标。叶绿素是一类与光合作用有关的色素，它是最为重要的光合色素。在一定范围内，光合强度随其含量增加而加强。因此它是反映植物丰产性能的生理指标之一。叶绿素的含量还可以在一定程度上检测植物毒性[23]。经不同处理后，小麦幼苗叶的叶绿素含量变化如图1A所示，不同处理组叶绿素含量没有表现出明显差异，可能是因为叶中粒子的浓度还不太大，还不足以影响植物叶绿素的含量。从图1B可以看出，不同处理下的小麦幼苗的根和叶中Fe含量有较大差异，3种纳米材料处理的小麦幼苗根中的Fe含量是显著大于两种离子处理的，在纳米材料处理的3组中，α-Fe2O3处理中Fe含量最高，γ-Fe2O3次之，Fe3O4最少，2种离子处理的幼苗则没有显著差异。纳米材料具有小尺寸效应、表面效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应等特殊理化性质，这些特性使纳米粒子更容易被小麦根部吸收[24]，本实验也证明了这一点。而叶中的情况则与根中相反，Fe2+处理的幼苗叶中Fe含量约是纳米材料处理中的2倍，可见离子比纳米材料更容易在植物中转运运输。有研究表明，植物能够吸收纳米材料并通过木质部或韧皮部进一步的转移到植物的其他部分[25]，但转运系数较低[26]，这与本研究中的发现一致。

2.2 小麦根生长状况和根系活力

同样，植物的地下部分也十分重要。植物根系是活跃的吸收器官和合成器官，根的活力水平直接影响地上部的营养状况及产量水平。不同处理下小麦幼苗根的生长状况如图2A所示，相比于其他处理组，Fe3+处理下的小麦根较稀疏，较短一些，图2B的结果也证实了这一点，Fe3+处理组比对照组根长减少了43.01 %。其他处理之间则没有显著差异，表明Fe3+有一定的植物毒性，减少了小麦的根系生长。在Adams等人的研究中，发现纳米粒子能够吸附在植物的根部[27]，在我们的研究中，也观察到了类似的现象，从图2A中，可以明显的看到，3种纳米材料处理的小麦幼苗根部吸附了大量的物质，使其表观颜色有了明显的变化。纳米材料在植物根部的富集也为植物吸收纳米粒子提供了可能性。除根长外，另一个能够直接判断植物根部生长状况的指标是根系活力。植物根系是活跃的吸收器官和合成器官，根的活力水平直接影响地上部的营养状况及产量水平。不同处理下的小麦幼苗的根系活力如图2C所示，只有Fe3+处理的植株根系活力显著升高，有研究表明，当植物根系因受到胁迫而导致生长减少时，植物会通过增加根系活力来补偿根系吸收面积的减小[28]，与本研究的结果一致,这表明Fe3+对小麦植物产生了一定的胁迫，但纳米粒子未表现出植物毒性，与Fe3+处理的毒害作用相比较，可以表明，纳米粒子对植物产生作用的方式并非释放Fe3+，而是通过其他方式对植物产生影响[29]。

2.3 小麦幼苗根和叶中丙二醛含量

当植物遭受干旱、盐、重金属等胁迫时，细胞中会产生大量的活性氧(ROS)[30-32]。在细胞内大量积累的活性氧会损害细胞，损伤之一就是导致膜脂过氧化，从而破坏膜结构。丙二醛是膜脂过氧化的最终产物，是衡量植物胁迫的重要指标。在对不同处理下小麦幼苗根和叶中丙二醛含量(图3)的分析中，可以看出，无论是根还是叶中，相比于对照组和正常处理组，Fe2+和Fe3+处理组的丙二醛都有显著的升高。而纳米材料处理的3个组中，只有纳米Fe3O4处理的小麦根MDA含量较正常处理组略有上升。而纳米α-Fe2O3处理的小麦叶中MDA含量较正常处理组下降了30.55 %。小麦幼苗在离子处理下产生了很大的氧化胁迫，并且造成了较大的膜损伤，其原因可能是相对于处理前的生长环境，大量的Fe2+和Fe3+在短时间内形成了一个逆境，使得MDA含量较高[33]。而这一指标显示纳米材料并未对植物产生胁迫。

图中CK代表缺铁改良霍格兰培养液处理，normal代表加铁改良霍格兰培养液处理。图中字母不同代表差异显著。下同CK represents iron deficiency and improved hogland culture solution treatment, while normal represents iron and improved hogland culture solution treatment. The letters in the picture represent significant differences. The same as below 图1 不同处理下小麦幼苗叶的叶绿素含量及叶和根的Fe含量Fig.1 Chlorophyll content in wheat seedling leaves under different treatments and Fe content of leaves and roots of seedlings under different treatments

图2 不同处理下小麦幼苗根的生长状况，根长和根系活力Fig.2 Root growth,root length and root activity of wheat seedlings under different treatments

图3 小麦幼苗根和叶中丙二醛含量Fig.3 Content of MDA in root and leaf of wheat seedling

2.4 小麦幼苗根和叶中花青素含量

为了保护细胞免受活性氧的潜在伤害，植物体发展了一套完整的防御体系，花青素就是其中重要的一员。花青素是一种广泛存在于植物体内的黄酮类化合物，此前的很多研究都表明，花青素与植物抗逆性有关，当植物遭受胁迫时，花青素含量上升[34-35]。如图4所示。在根中，除纳米α-Fe2O3处理使得花青素含量相比于对照组和正常处理组增多外，其他处理间没有显著性差异。而在叶中，3种纳米材料的处理使得叶的花青素含量相比于正常处理组下降，但与对照组相比没有显著差异。总的来说，纳米材料的处理在一定程度上降低了植物叶的花青素含量，离子处理对花青素含量没有影响，说明纳米粒子并未对植物造成胁迫。

图4 小麦幼苗根和叶中花青素含量Fig.4 Anthocyanins in roots and leaves of wheat

图5 小麦幼苗根和叶中超氧化物歧化酶(SOD)活性,过氧化氢酶(CAT)活性和小麦幼苗根和叶中过氧化物酶(POD)活性Fig.5 SOD activity,CAT activity and POD activity in root and leaf of wheat seedlings

2.5 小麦幼苗根和叶中抗氧化酶活性

2.6 小麦幼苗根和叶可溶性蛋白和可溶性糖含量

小麦幼苗根和叶中可溶性蛋白的含量如图6A所示。可溶性蛋白也可以在细胞受损时起到保护作用，可溶性蛋白是细胞的重要组成部分，通过代谢等途径来调节细胞渗透压[38]，且蛋白质参与细胞的所有新陈代谢活动。其含量在生物体内维持着一定程度的代谢平衡，而当植物受到一定的胁迫或者自身发育生长衰老时，这一平衡才会有所波动[39]。从图中可以看出，不同处理下小麦根中的可溶性蛋白含量没有显著差异，而在叶中，Fe2+处理组的小麦叶可溶性蛋白含量相比于对照组和纳米α-Fe2O3、Fe3+处理组有明显上升，相比于对照组也上升了27.47 %，纳米Fe3O4处理组的可溶性蛋白含量相比于纳米α-Fe2O3和Fe3+处理组也上升了，因此，纳米Fe3O4与Fe2+显示出了一定的毒性，且该图中蛋白质含量的变化与图4中3种酶含量的变化基本一致。

可溶性糖作为生物体一种重要的能源物质，也参与细胞中的一些应激反应，在植物遭受胁迫时，会合成可溶性糖以提高植物抗性。研究表明，在胁迫下，植物体内可溶性糖的含量与MDA含量呈正相关[40]。如图6B所示，在小麦叶中，Fe2+和Fe3+处理组的可溶性糖含量比对照组和正常处理组对比都有明显上升，Fe3+处理组的根中的可溶性糖含量相比于对照组也升高了51.46 %，这与图3中MDA含量的变化一致。说明50 mg/L的离子处理对植物造成了一定的氧化胁迫。此外，纳米Fe3O4处理下的小麦叶中可溶性糖的含量也有所上升。

3 讨 论

本文主要研究3种纳米氧化铁和两种离子对小麦幼苗生理效应的影响，通过小麦幼苗叶绿素、Fe含量、根系活力、抗氧化酶体系的酶活性、MDA等生理生化指标的变化来进行评估。Fe含量分析的结果表明，在50 mg/L的Fe元素浓度下，3种纳米粒子(α-Fe2O3、γ-Fe2O3、Fe3O4)和两种离子(Fe2+、Fe3+)处理的小麦幼苗植株根和叶中Fe含量都高于对照组和正常处理组，其中纳米粒子处理组中Fe的总含量要高于离子处理组，可能是由于纳米粒子粒径较小，易被吸收，但离子处理组的转运率(从根到叶)更高，目前关于纳米颗粒在植物体内的转运机制还不清楚，有学者认为只有粒径小于0.5 nm的颗粒才能在植物体内运输[41]，这也可能是本实验中转运系数低的主要原因，这启发之后可以设计不同粒径的纳米氧化铁来进行试验，以期找到一个更好的纳米氧化铁作为铁肥。从理论上来看，这5个处理确实可以起到补铁的作用，但是，从对小麦生理指标检测的结果来看，Fe2+和Fe3+处理比3种纳米氧化铁展现出了更大的植物毒性，具体表现为膜脂过氧化程度加剧、抗氧化酶体系(SOD、CAT、POD酶)中酶活性上升、可溶性糖含量增加等。3个纳米氧化铁处理组的比较中，纳米Fe3O4表现了较大的毒性，而α-Fe2O3和γ-Fe2O3处理的小麦几乎没有表现出毒性，但却起到了补铁的作用。因此，选用纳米材料进行补铁是一个可行的方向，进一步研究纳米粒子进入植物的途径以及在植物体内存在的形式，并加深到相关调控机制的分子层面可能会有新的突破。

图6 不同处理下小麦幼苗根和叶中的可溶性蛋白含量和可溶性糖含量Fig.6 Soluble protein content soluble sugar content in roots and leaves of wheat seedlings under different treatments

4 结 论

综上所述，高浓度离子型Fe的添加对植物生长造成了胁迫，而纳米α-Fe2O3和γ-Fe2O3展现了较小的植物毒性，且易被植物吸收利用，可以考虑在缺铁的情况下尝试用于农业中代替传统铁肥，以缓解植物的缺铁症状。考虑到纳米材料对环境问题和人体健康问题的危害还不清楚，因此在实际应用前还需仔细展开纳米粒子安全性的研究。