土荆芥挥发油诱导玉米保卫细胞Caspase依赖性凋亡及信号调节

黄 素，李 洁，马丹炜*，花敏瑞，江文倩，肖 杨，陈丽娜，全津莹

(1.四川师范大学生命科学学院，四川 成都 610101；2.四川省农业科学院农业信息与农村经济研究所，四川 成都 610066)

【研究意义】玉米(ZeamaysL.)是我国种植面积最大的重要作物，遍及二十多个省区，用途广泛[1]。多种非生物胁迫会影响玉米的生长发育，导致玉米减产，如光照较弱时玉米籽粒败育粒增加、体积减小、干重降低[2]；干旱胁迫导致玉米叶片光系统Ⅱ和抗氧化酶系统受损[3]；土壤含水量过高时玉米幼苗生物量显著下降等[4]，而生物胁迫研究较少。【前人研究进展】土荆芥(ChenopodiumambrosioidesL.)为藜科藜属一年生或多年生的芳香性草本入侵植物，原产美洲热带，极易扩散于农田中，该种含有毒挥发油，对其他植物产生化感作用[5]。研究表明，土荆芥挥发油可使玉米根尖细胞内ROS爆发，相关基因表达改变，抗氧化系统受到影响[6]，阻碍玉米根毛发育，降低玉米种子活力，从而影响玉米的生长发育，成为优势物种[7]。【本研究切入点】气孔保卫细胞是植物响应外界的第一门户，对保卫细胞不利的胁迫将影响植物的光合作用，ROS、NO和Ca2+等信号分子常参与调节细胞对外界胁迫的响应[8]，而土荆芥挥发油是否影响玉米保卫细胞的功能及其作用机制不得而知。【拟解决的关键问题】因此，本研究以玉米为对象，分析土荆芥挥发油对其保卫细胞的毒性作用，首次利用末端脱氧核苷酸转移酶生物素-dUTP缺口末端标记法(TUNEL)检测化感胁迫后玉米保卫细胞凋亡情况，探讨保卫细胞核形态、活性及胞内信号分子对土荆芥化感胁迫的响应，有利于揭示土荆芥诱导的保卫细胞凋亡现象及其机理，为深入了解入侵植物的胁迫机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

土荆芥地上部分采于四川成都包江桥，水蒸气蒸馏法提取挥发油[9]，无水Na2SO4干燥，4 ℃保存；玉米种子(雅玉26#)购于四川西南科联种业公司；TUNEL试剂盒产自Beyotime公司。

1.2 方法

1.2.1 材料培养及处理 选种后，0.5 %KMnO4消毒10 min，25 ℃暗培浸种24 h后催芽，取萌发一致的种子种于营养土中(花盆直径14 cm，高12 cm)，25 ℃光暗周期14/10 h培养。4周取第2层平展叶片备用。

二甲基亚砜(DMSO)配制浓度为0.10 μl/μl的挥发油母液。撕取下表皮切成1 cm×0.5 cm表皮条，放入加有5 mL MES缓冲液[8]的EP管，分别加入2、4、6、8、10 μl挥发油母液，DMSO补足10 μl，25 ℃光照培养10、20、30 min，设置空白对照和溶剂对照(10 μl DMSO)。

以泛Caspase抑制剂(Z-VAD-FMK:0.05,0.1,0.15 μmol/L)，抗坏血酸(AsA:0.05,0.1,0.5 mmol·L-1)，过氧化氢酶(CAT:100, 200, 300 U·mL-1)，Ca2+螯合剂(EGTA: 0.05, 0.1, 0.5 mmol·L-1)，Ca2+通道抑制剂(LaCl3: 0.05, 0.1, 0.5 mmol·L-1)，硝酸还原酶抑制剂(NaN3:0.05,0.1,0.2 mmol·L-1)和NO合成酶抑制剂(L-NAME:0.025,0.05,0.075 mmol·L-1)为拮抗剂，分别将拮抗剂与8 μl挥发油母液加入缓冲液，混匀后放入表皮条，25 ℃光照培养30 min，设置空白对照和挥发油对照(挥发油母液8 μl)。

1.2.2 细胞活性和细胞核形态检测 细胞活性检测参照马丹炜等[10]方法，AO/EB避光染色3 min，LEICA DM 3000显微镜观察。细胞核形态检测采用Feμlgen染色法[10]，Schiff试剂避光染色1 h。LEICA DFC450C显微镜观察。每个处理观察1000个保卫细胞，重复3次。

1.2.3 TUNEL检测 将表皮条加入含8 μl挥发油母液的缓冲液中，25 ℃光照培养30 min，PBS洗涤3次，卡诺氏液4 ℃固定2 h，PBS洗涤3次，4 %(m/v)果胶酶和2 %(m/v)纤维素酶37 ℃酶解10 min，PBS洗涤3次，0.2 % Triton x-100处理30 min，PBS洗涤3次，TUNEL反应混合物避光染色90 min，PBS洗涤后制片。

1.3 数据统计与分析

Microsoft Excel 2007进行数据录入和作图，SPSS 17.00进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 土荆芥挥发油对玉米保卫细胞核形态的影响

形态观察发现，对照组保卫细胞核形态规则(图1a1,a2)，挥发油处理组保卫细胞出现核固缩(图1b1,b2)，核断裂(图1c1,c2)等现象。同一处理时间下，处理组细胞核异常率较对照组显著增加(P<0.05)，其中10 μl挥发油母液处理30 min时核异常率达到最大(75.57 %)。同一剂量下，细胞核异常率随处理时间增加而显著上升(P<0.05，6 μl挥发油母液处理20、30 min组间和8 μl挥发油母液处理20、30 min组间除外)。表明土荆芥挥发油对玉米保卫细胞具有强烈的毒性，且与细胞核畸变率存在剂量效应与时间效应。

a：对照；b：核固缩；c：核断裂(1. AO/EB染色，2. Schiff试剂染色)a：CK；b：Nuclear pyknosis；c：Nuclear fragmentation(1.AO/EB staining，2.Schiff reagent staining)图1 土荆芥挥发油处理下玉米保卫细胞核形态的变化Fig.1 Nuclear morphology changes in the guard cells of Zea mays L. exposed to volatile oil from Chenopodium ambrosioides L.

图2 土荆芥挥发油对玉米保卫细胞核形态的影响Fig.2 Effect of volatile oil from Chenopodium ambrosioides L.on guard cell nucleus morphology in Zea mays L.

2.2 土荆芥挥发油对玉米保卫细胞活性的影响及其信号调节

AO/EB染色后观察发现，对照组保卫细胞的细胞核发亮绿色荧光，显示较高活性(图1a1)，处理组细胞核发橘红色荧光，即细胞活性降低(图1b1,c1)。图3显示，相同处理时间下，除少数低剂量组(2 μl)保卫细胞死亡率与对照组无显著差异外，其余组均随处理剂量增加而增大(P<0.05)，10 μl组处理30 min时，细胞死亡率高达85.94 %。同一剂量下，除2 μl组处理20、30 min之间无显著差异外，其余组细胞死亡率均随处理时间增加而上升(P<0.05)。可见土荆芥挥发油可诱导保卫细胞死亡，具有显著的细胞毒性，与细胞死亡率存在剂量效应与时间效应。

大写字母表示同一时间，不同剂量处理组间差异；小写字母表示同一剂量，不同时间处理组间差异；P<0.05，下同Uppercase letters indicate the same time, different doses of treatment group differences; Lowercase letters that the same dose, different time treatment group differences; P<0.05, The same as below图3 土荆芥挥发油对玉米保卫细胞活性的影响Fig.3 Effect of volatile oil from Chenopodium ambrosioides L.on guard cell viabilities in Zea mays L.

a：光学显微镜下的玉米保卫细胞；b：对照；c：TUNEL阳性a：The guard cells of Zea mays L. under optical microscope；b：CK；c：TUNEL-positive图4 玉米保卫细胞的TUNEL原位检测Fig.4 The TUNEL assay in the guard cells of Zea mays L.

TUNEL检测发现保卫细胞核DNA的3′-OH断端可被特异标记为绿色，呈TUNEL阳性(图4c)，而对照组则不被TUNEL特异性标记呈无荧光的阴性结果(图4b)，说明挥发油处理后，保卫细胞出现大量DNA断裂为片段的细胞凋亡特征。加入泛Caspase抑制剂Z-VAD-FMK后，保卫细胞死亡率显著降低(P<0.05，图5)，表明土荆芥挥发油诱导的玉米保卫细胞死亡属于Caspase依赖性的细胞凋亡。

不同浓度的AsA、CAT、EGTA、LaCl3、NaN3和L-NAME分别与8 μl挥发油一起处理表皮条后，保卫细胞死亡率均显著降低。其中,0.5 mmol·L-1AsA，300 U·mL-1CAT，0.5, mmol·L-1EGTA，0.5mmol·L-1LaCl3，0.20 mmol·L-1NaN3和0.075 mmol·L-1L-NAME处理时保卫细胞死亡率最低，分别为21.10 %、53.57 %、34.61 %、33.76 %、46.73 %和36.21 %，显示高浓度拮抗剂处理对保卫细胞死亡的缓解作用最大。上述结果说明，ROS、NO、Ca2+等信号分子参与了土荆芥挥发油诱导玉米保卫细胞凋亡的信号调节。

LC：低浓度缓解剂；MC：中等浓度缓解剂；HC：高浓度缓解剂LC：Low concentration inhibitor；MC：Medium concentration inhibitor；HC：High concentration inhibitor图5 拮抗剂对土荆芥挥发油诱导保卫细胞死亡的缓解作用Fig.5 Alleviating effects of antagonists on guard cell death of Zea mays L. induced by the volatile oil from Chenopodium ambrosioides L.

3 讨 论

3.1 土荆芥挥发油对玉米保卫细胞的毒性作用

入侵植物释放的挥发性化感物质具有强烈的细胞毒性，如加拿大蓬(ErigeronCanadensisL.)挥发油诱导蚕豆(ViciafabaL.)保卫细胞活性降低，细胞核畸变[11]；土荆芥挥发油使大豆[Glycinemax(Linn.) Merr.]根边缘细胞数减少，存活率降低[12]；桉(EucalyptusrobustaSmith)挥发油引起莴苣(LactucasativaL.)根尖分生组织细胞核固缩，染色体发生变异，诱导细胞死亡[13]。本研究表明，土荆芥挥发油具有较高的细胞毒性，使玉米保卫细胞核形态出现核固缩、断裂等细胞凋亡特征，导致细胞死亡，且细胞核畸变率和细胞死亡率与浓度存在剂量效应与时间效应。

3.2 ROS、NO和Ca2+参与土荆芥挥发油诱导的保卫细胞Caspase依赖性凋亡

细胞发生凋亡时，核小体间的DNA开始随机断裂，激活Caspase途径，诱导内切核酸酶被活化，将DNA降解成寡聚核小体片段，促使细胞凋亡[11]。DNA片段化是细胞凋亡的重要特征，TUNEL原位末端标记法是公认检测细胞凋亡的有效指标[14]，Li等[15]研究表明，土荆芥挥发油能诱导玉米根尖细胞核DNA断裂，发生细胞凋亡。本研究也证实，土荆芥挥发油诱导保卫细胞活性降低，TUNEL检测为阳性，显示出保卫细胞核DNA断裂，裸露出游离的3′-OH末端，具有明显的细胞凋亡特征，加入泛Caspase抑制剂Z-VAD-FMK可抑制该过程，说明保卫细胞发生了Caspase依赖性的细胞凋亡，这是玉米对土荆芥化感胁迫的自主响应，以防止有害物质进入其他组织，维持机体内部平衡。

化感胁迫往往伴随着氧化胁迫，ROS是植物细胞在抵抗环境胁迫过程中的一个重要信号分子[16]，细胞具有抗氧化防御机制，正常情况下，胞内ROS含量不高，化感胁迫下，叶绿体和线粒体的功能受到影响，导致大量ROS在细胞中积累，氧化与抗氧化作用一旦失衡，核DNA将受到氧化损伤，导致碱基缺失，DNA断裂等，凋亡可能是细胞响应这种失衡的结果[17]；NO是一种具有自由基性质的脂溶性气体信号分子，可透过细胞膜快速扩散，已被证实作用临近靶细胞参与众多生理病理过程[18]，伴随ROS爆发，细胞内NO的合成达到高峰，细胞活性将受到影响[19]。细胞常通过ROS和NO介导第二信使Ca2+信号通路响应胁迫应答，ROS激活质膜Ca2+通道引起胞外Ca2+内流，增加胞内Ca2+水平，通过活化核酸内切酶依赖性Ca2+，在核小体连接切割DNA，从而激活Caspase家族成员，导致细胞凋亡[8,11,20]。本研究中，分别加入AsA，CAT，EGTA，LaCl3，NaN3或L-NAME后，保卫细胞死亡率显著降低(P<0.05)，推测土荆芥挥发油诱导玉米保卫细胞内ROS和NO水平升高，激活细胞膜上的Ca2+通道，导致胞内Ca2+浓度升高，激活Caspase依赖性途径，活化核酸内切酶切割核DNA，导致核DNA片段断裂，最终诱导保卫细胞凋亡。

4 结 论

土荆芥挥发油具有细胞毒性，导致玉米保卫细胞的核形态改变，细胞活性减低，其作用机制可能通过诱导保卫细胞内ROS和NO爆发，激活质膜Ca2+通道，引发胞内Ca2+增加，从而介导保卫细胞发生Caspase依赖性的细胞凋亡。