基于网络药理学的杜仲干预创伤性股骨头坏死作用机制研究*

田涛涛，石淇允，李无阴

（河南省洛阳正骨医院/河南省骨科医院，河南 洛阳 471002）

创伤性股骨头坏死是髋部受到损伤后引起的严重并发症，多数文献报道髋部损伤后其出现股骨头坏死率为12%～86%[1-2]。近年来，以股骨颈骨折为主的髋部损伤疾病逐年上升，且趋于低龄化[3]。目前，多数指南建议对于60岁以上的患者可直接行髋关节置换来降低治疗后期出现坏死二次手术的概率。但对于中青年患者尚未形成统一治疗方案[4]。中医药在治疗慢性复杂性疾病具有一定的优势，部分临床研究发现运用中医药来防治创伤性股骨头坏死的发生及发展效果良好，但中医治疗讲究中药君臣佐使联合用药，在治疗创伤性股骨头坏死也多采用复方[5-6]，因此，临床中对于每味中药的贡献值并不清晰。

杜仲，味甘，性温，归肝、肾经，具有补肝肾，强筋骨的作用。现代药理学已证实其主要含环烯醚萜类、黄酮类、苯丙素类、酚类等成分，但关于其具体作用机制的相关研究较少[7-8]。杜仲治疗创伤性股骨头坏死是多靶点、多环节作用的共同结果，虽然临床中大量应用杜仲来治疗创伤性股骨头坏死并取得较好的疗效，但多数研究仍针对单一的靶点进行分析，这不能全面整体的反应杜仲的作用机制[9-10]。网络药理学遵循中医理论，综合现代医学理论与技术，能够整体、系统的分析杜仲改善创伤性股骨头坏死的机制。本研究采用网络药理学来探索杜仲干预创伤性股骨头坏死可能的作用机制。

1 资料与方法

1.1 药物活性成分的筛选 在中药系统药理学数据库与分析平台 （TCMSP，Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）搜索关键词“杜仲”获得其活性成分信息，并设置其口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18为筛选条件进行筛选。

1.2 药物作用靶点预测与疾病靶点查询 在U－niprot 数据库（https：//www.uniprot.org/）UniprotKB 检索功能对各靶点人类基因简称进行查询，获取杜仲可能存在的靶蛋白。在GeneCards数据库（https：//auth.lifemapsc.com）中以“traumatic necrosis of femoral head”为检索词进检索，获取创伤性股骨头坏死已知的靶蛋白。

1.3 共同靶点的确定 采用Venny图获取药物（杜仲）靶点与疾病（创伤性股骨头坏死）靶点的交集为共同靶点。

1.4 成分-靶点网络构建 将确定的药物疾病共同靶点导入Cytoscape3.7.2（美国），构建“成分-靶点”网络图。

1.5 蛋白相互网络的构建 将取交集后的靶点导入在线系统 String11.0（http：//string-db.org/），获得蛋白质相互作用（PPI）网络。

1.6 生物通路的分析 对杜仲的作用靶标进行基因本体论（GO）分析与京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，得到通路富集结果，并绘制典型通路信息图。

2 结果

2.1 杜仲的活性成分及相应靶蛋白 在TCMSP数据库中共检索出147种杜仲活性成分，经过筛选得到符合标准的成分28种。表1。

表1 杜仲生物活性成分

2.2 药物靶点预测及共同靶点的确定 在Uniprot数据库中输入潜在靶标的PDB ID，并剔除重复的基因靶标后共得到102个。在GeneCards数据库（https：//auth.lifemapsc.com）中以“traumatic necrosis of femoral head”为检索词进检索，获取创已知的疾病靶点542个。取两者交集为共同靶点共42个。见图1、表2。

表2 杜仲潜在靶标

图1 共同靶点

2.3 成分-靶点与疾病靶点网络 使用Cytoscape 3.7.2建立杜仲干预创伤性股骨头坏死网络图，见图2。该图中有靶蛋白的节点58个，表示相互作用的线149条。

图2 杜仲干预创伤性股骨头坏死成分-靶点网络图

2.4 蛋白质相互作用网络构建 使用String数据库获取杜仲与创伤性股骨头坏死相关靶标的相互作用关系，导入Cytoscape软件，构建靶标相互作用网络。网络图种共包含节点42个，线320条。见图3。

2.5 GO生物学功能分析 将42个潜在靶点映射到DAVID数据库中，进行生物学功能富集，系统的分析其生物过程。共富集到65条生物过程，其中P≤0.01的生物过程共有55条。见图4。

图3 杜仲干预创伤性股骨头坏死PPI图

图4 GO功能富集分析条形图

2.6 KEGG通路分析 通过KEGG通路富集分析，筛选出62（P≤0.01）条通路与杜仲防治创伤性股骨头坏死的作用相关。见图5。杜仲对PI3K/Akt signaling pathway信号通路作用靶点标注图。见图6。

3 讨论

创伤性股骨头坏死是较为复杂的常见骨病之一，其发生发展受多种因素的调控[11]。目前多数治疗仅能延缓疾病的进展[12]。中医认为创伤性股骨头坏死多属于肾虚血瘀，是机体收到创伤后导致气血运行失常，前期以“瘀”为主要病机，疾病发展后期以“虚-瘀”为主要特点[13]。而杜仲是常用的补益类药物，大量治疗创伤性股骨头坏死的复方中均应用杜仲，但尚无研究提出杜仲为复方中主要改善创伤性股骨头坏死的药物。

图5 KEGG通路富集分析条形图

图6 杜仲成分在创伤性股骨头坏死相关通路中的作用靶点标注图

本研究采用网络药理学的方法，发现杜仲的有效活性成分可能通过调节PTGS1、BCL2、PON1、PPARG、ICAM1等相关靶点来防治创伤性股骨头坏死[14-16]。这些靶点主要为调控成骨细胞和破骨细胞的代谢平衡、促进或抑制血管的新生和凋亡、改善内环境的炎症反应等。将预测到的42个目标靶点导入KEGG Pathway数据库，得到目标靶点在PI3K/Akt signaling pathway、Proteoglycans in cancer，Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection等信号通路上的相关调控过程，证实了杜仲多靶点，多途径的参与防治创伤性股骨头坏死的发生发展[17-18]。如PI3K/Akt信号通路是调控人体细胞分化、增殖与凋亡的重要信号通路，多数学者认为认为它可能是影响骨转换的平衡重要通路[19]。

综上所述，通过网络药理学的研究方法能够证实杜仲可多途径、多靶点防治创伤性股骨头坏死的发生发展。杜仲各种活性成分间存在着密切的协同关系，其主要的靶点也在创伤性股骨头坏死中发挥着至关重要的作用，这将有助于进一步研究中医药防治创伤性股骨头坏死。