鲍鱼对2种多环芳烃的富集动力学研究

魏海峰，赵肖依,2，王闯,2，刘潘,2，刘长发,2,*，黄欣,2，霍玉洁,2，赵雨朦,2，夏宁,2

1. 大连海洋大学，辽宁省海洋近岸海洋环境科学与技术重点实验室，大连 116023 2. 大连海洋大学，海洋科技与环境学院，大连 116023

多环芳烃化合物(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)是指由2个或2个以上苯环以线状、角状或簇状排列的中性或非极性碳氢化合物，是一类典型持久性有机污染物，具有强致癌和致突变性[1]。多环芳烃因其化学性质稳定、生物富集量高、难降解等特点，被列为海洋环境监测的指标之一[2-3]。

海洋环境中PAHs污染主要来源于海洋溢油事故以及沿海石油化工企业的废水排放[4]。2008年我国进口石油2亿吨的90%经海洋运输。2010年大连“7.16溢油”和2011年蓬莱“19-3溢油”事故中，多环芳烃是一类重要的污染因子[5-6]。近年来，国内外学者对海洋中多环芳烃开展了相关研究，取得了一定的研究进展。高颖等[7]研究了海水和海洋沉积物中多环芳烃的分布情况，发现我国南黄海海水中PAHs溶解态和颗粒态中PAHs的总浓度为15.8～233.4 ng·L-1；大辽河口、黄河口中海洋沉积物中的PAHs含量均较高，其中大辽河口海洋沉积物中PAHs的含量范围为276.3～1 606.9 ng·g-1；河口区域海洋沉积物中PAHs略高于近岸海域沉积物中PAHs。叶志波等[8]研究了消油剂对海洋溢油中PAHs环境行为的影响，发现消油剂能增大溢油中PAHs在海水中的溶解度，促进形成粒径更小的化学分散油滴，而较小的油滴更容易和海洋中悬浮颗粒物(suspended particulate matter, SPM)作用形成油-颗粒物聚集体(oil-SPM aggregates, OSAs)。此外，消油剂还会对溢油的迁移及PAHs的生物降解产生影响。郑关超等[9]研究了环渤海地区养殖水产品中PAHs污染残留及健康风险的问题，发现该区域养殖水产品中PAHs污染状况较为普遍，尤其是菲的平均含量及检出率最高；还发现PAHs污染表现出一定的生物相关性。

菲是最具代表性的三环PAHs，其在石油中含量较高，而3-甲基菲是菲的烷基化衍生物，存在于烟气之中[10]。蒽的9,10位比较活泼，很容易发生诸如溴化、醛化、溴甲基化等反应而与其他化合物作用形成功能材料[11]。9,10-甲基蒽多用于有机合成、染料制备。多环芳烃的化学性质与其结构相关，针对多环芳烃的结构特征，一些学者提出了“K区”理论和“L区”理论。具有3～4环的PAH，因分布广泛、烷基大小、组成不同构成了一系列化合物，这类化合物的持久性可以导致慢性毒性的发生，并且可以小到被水生生物富集在组织体内[12]。3-甲基菲和9,10-甲基蒽是中国海洋溢油优先监测的16种多环芳烃(PAHs)中的2种。鲍鱼作为北方地区具有极为重要经济价值和食用价值的经济动物，然而随着海洋环境污染加重，鲍鱼对PAHs的生物富集成为影响鲍鱼生长发育和威胁人体健康的重要因素[13-14]。但是目前国内外对于PAHs在鲍鱼体内富集过程研究较少。依据PAHs在海洋环境中的分布特征和海洋生物在海洋生态系统中的重要作用，本研究选择皱纹盘鲍作为受试生物，开展了3-甲基菲和9,10-甲基蒽2种多环芳烃对鲍鱼的毒性作用研究，以期为确定我国海洋环境多环芳烃的环境基准、保护海洋生态环境提供基础数据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验材料

实验用海水为来自大连黑石礁海域的砂滤海水，盐度为30～31，pH为7.8～8.1，进行沙滤充分曝气后使用。实验用鲍鱼苗，壳长(3±0.3) cm，购买自大连太平洋海珍品有限公司，于实验室海水养殖循环系统中暂养1周后，选取健康的个体用于实验。气相色谱质谱联用仪(GC6890N/MSD5975B, Agilent Co, USA)；加速溶剂提取仪(ASE350, Dionex Co, USA)；Heidolph旋转蒸发仪(Hei-VAP, 德国)；所有试剂(正己烷、二氯甲烷、丙酮)均为农残级，购自TEDIA公司，硅胶(0.100 mm)购自Merck公司，弗罗里硅土(Florsil, 60～100目)购自美国Floridin公司。内标(替代内标Z-014J：含菲-d10和芘-d12；进样内标：三联苯-d14)购自Wellington公司。3-甲基菲和9,10-甲基蒽是我国海洋溢油优先监测的几种PAHs，在所有水产养殖海域监测中均有发现。因此选择此2种PAHs作为研究对象。实验用3-甲基菲和9,10-甲基蒽购买自Sigma公司(Sigma-Aldrich Corporation, USA)，纯度分别大于97%和98%；使用丙酮(浓度为99.5%)作为助溶剂将2种PAHs配制成一定浓度的母液。

1.2 生物蓄积实验

通过96 h急性毒性实验得到2种PAHs 3-甲基菲和9,10-甲基蒽对鲍鱼的半致死浓度LC50分别为653.7 μg·L-1和488.5 μg·L-1。以此为依据设置2种PAHs的生物蓄积实验所需PAHs的浓度。3-甲基菲浓度分别为5、10、100 μg·L-1，9,10-甲基蒽的浓度分别为5、10、50 μg·L-1。另外设置1组海水对照组，1组丙酮对照组，丙酮浓度为所加入所有体系的最大量的0.01%。每组设置3个重复，每个1 L玻璃烧杯中放入鲍鱼12只。试验期间保持充氧，使水中溶解氧浓度保持6 mg·L-1以上，实验水温为18～20 ℃，每天定时投喂一次鲜海带，投喂量为体质量(以第一次称重为准)的1.5%。以此时为时间起始点，每天换一次新鲜海水，投加相应的污染物至所设置的浓度。取样时间，自实验开始第3、7、14天取样，每次每个处理组取鲍鱼3只，用锡箔纸包裹，放入-80 ℃冰箱保存待测。

1.3 样品处理

本文对鲍鱼体内3-甲基菲和9,10-甲基蒽的测定方法依据李天云等[15]对生物体内多环芳烃测定所采用的气相色谱-质谱法。全量称取冷冻干燥后的生物样品，加入无水硫酸钠和氘代回收率指示物(Z-014J, 10.0 μg·mL-1)用来控制样品前处理的目标化合物的回收率，用100 mL正己烷和丙酮混合溶液(1:1,V:V)进行加速溶剂萃取，萃取温度100 ℃，加热时间5 min，静态时间10 min，循环3次，冲洗体积60%，吹扫时间60 s。样品提取液过无水硫酸钠小柱，加盐酸处理过的铜粉除硫：生物样品提取液直接转入洁净的烧瓶中，加入一定量(视有机相的透明度而定)的酸性硅胶，磁力搅拌约0.5 h。去除脂肪等大分子杂质将萃取液浓缩至2.0 mL左右，浓缩液过佛罗里土(5.0 g)与硅胶(8.0 g)复合柱净化，50 mL正己烷预淋洗，80 mL正己烷/二氯甲烷(1:1,V:V)淋洗液，接取淋洗液浓缩定容至200 μL，添加1 μL进样内标(三联苯-d14, 10.0 μg·mL-1)。上机测定，加入内标的作用为了消除系统误差及定量目标化合物。样品采用DB-5ms毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)进行气相分离，采用EI源电离方式进行质谱检测。色谱柱升温程序为：50 ℃开始，不停留；以4 ℃·min-1升温到220 ℃，停留3 min；以10 ℃·min-1升温到300 ℃，停留9 min。载气(氦气)流速为1.0 mL·min-1，恒流，进样口温度280 ℃，无分流进样，进样量为1 μL；传输线温度290 ℃，四极杆温度150 ℃，离子源温度230 ℃，离子扫描为SIM模式。

所有样品和空白中标准替代内标3-甲基菲和9,10-甲基蒽回收率分别71.2%～83.9%和65.5%～88.3%，相对标准偏差分别为7.3%和6.7%，每个样品3个平行测试。空白实验结果显示所有目标物低于方法检测限，文中给出的数据均已经过回收率校准。

1.3.1 双箱动力学模型

双箱动力学模型是在近几年发展起来的一类数学模型，主要用于重金属、有机污染物的生物富集研究，它能较好地描述污染物在水体与生物体之间的作用过程，并能模拟出达到生物富集平衡情况下的动力学参数(图1)。

图1 生物富集双箱动力学模型Fig. 1 Two-compartment kinetic model of bioconcentration

双箱动力学模型生物富集公式为：

CA=C0+Cw×K1/K2×(1-e-K2t) (0

(1)

其中：CA为生物体中PAHs浓度(ng·g-1)；C0为实验开始前生物体内PAHs浓度(ng·g-1)；K1为吸收速率常数，K2为释放速率常数，Cw为水体中PAHs浓度(μg·L-1)，t*为富集天数。由方程(1)进行非线性拟合可得到K1、K2。

理论平衡状态下BCF用公式(2)表示：

BCF=K1/K2=limCA/Cw(t→∞)

(2)

生物半衰期公式：

t1/2=ln2/K2

(3)

富集达到平衡时，生物体内PAHs含量Cmax用公式表示为:

Cmax=BCF×Cw

(4)

1.3.2 模型的拟合优度检验

应用MatLab2014A对数据进行非线性拟合，根据3个实验浓度的生物富集量数据获得3个方程(1)，以上3个方程(1)联立，可得到K1、K2，结合判定系数R2来评价该模型的拟合优度，并采用F检验对模型整体的显著性进行检验，以此验证双箱模型用于鲍鱼对PAHs的生物富集研究的可行性。采用SSPS 13.0软件(SPSS Inc.)对实验数据进行方差分析和回归分析。采用ANOVA方法分析PAHs暴露组与空白对照组之间的差异，P<0.05、P<0.01表示差异显著。

2 结果(Results)

从图2可知，空白对照组和丙酮对照组检测出少量的9,10-甲基蒽，由于对照组并未加入该污染物，因此可以判定对照组中的9,10-甲基蒽来自环境本底值。随着暴露时间的延长，9,10-甲基蒽在鲍鱼体内的蓄积量也有所增长，说明鲍鱼体内没有或者有少部分代谢的途径无法通过该途径使9,10-甲基蒽代谢出体外。如表1所示，随暴露时间的延长鲍鱼体内的蓄积量越来越多，浓度为5 μg·L-1条件下，符合双箱动力学模型，K1=1.494，K2=0.101，R2=0.977(95%置信区间)。9,10-甲基蒽在10 μg·L-1浓度条件下随着暴露时间的延长，9,10-甲基蒽在鲍鱼体内的蓄积量也有所增长，符合双箱动力学模型，K1=3.906，K2=0.584，R2=0.760(95%置信区间)。在50 μg·L-1浓度下，9,10-甲基蒽在鲍鱼体内的蓄积量随时间一直增加，使用双箱动力学模型进行拟合，K1=9.431，K2=0.533，R2=0.759(95%置信区间)。在5 μg·L-1和10 μg·L-1浓度下，3～14 d生物蓄积量之间差异不显著(P<0.05)，认为在第3天达到富集平衡。

从图3可知，在5 μg·L-1浓度的情况下鲍鱼对于3-甲基菲富集第3天富集量与第14天富集量之间无显著差异(P<0.05)，说明鲍鱼对3-甲基菲富集在第3天达到了平衡。如表1所示，在5 μg·L-1浓度下，鲍鱼符合双箱动力学模型，K1=3.308，K2=0.462，R2=0.912(95%置信区间)。10 μg·L-1浓度下，随着3-甲基菲浓度的升高，3-甲基菲在鲍鱼体内的蓄积量明显增加，其双箱动力学模型参数分别为K1=3.061，K2=0.261，R2=0.994(95%置信区间)。在100 μg·L-1的浓度下，鲍鱼体内3-甲基菲随着暴露时间的延长蓄积量也有所增长。此浓度下K1=0.538，K2=0.377，R2=0.919(95%置信区间)。

图2 9,10-甲基蒽在鲍鱼体内富集过程Fig. 2 Enrichment of 9,10-dimethylanthracene in abalone Haliotis discus hannai

图3 3-甲基菲在鲍鱼体内富集过程Fig. 3 Enrichment process of 3-methylphenanthrene in abalone Haliotis discus hannai

表1 鲍鱼对2种多环芳烃(PAHs)3 d、7 d和14 d的生物富集动力学参数Table 1 Bioaccumulation kinetic parameters of two polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) (3 d, 7 d and 14 d) with different concentrations of H. discus hannai

注：BCF表示生物富集因子，Cmax表示平衡状态下鲍鱼体内2种多环芳烃的含量，t1/2表示生物学半衰期。

Note: BCF represents biological enrichment factor;Cmaxrepresents the content of two polycyclic aromatic hydrocarbons in abalone at equilibrium;t1/2represents the biological half-life.

3 讨论(Discussion)

PAHs一旦通过各种途径进入水生生物体内，易积累于生物脂肪中，形成生物富集，对生物体造成巨大的伤害[16]。目前，有关PAHs的生态毒理学研究大部分涉及陆生动物和淡水生物[17-20]。李磊等[21]研究了苯并[a]芘、菲在缢蛏体内的富集情况，发现缢蛏对苯并[a]芘的富集能力高于菲；缢蛏对苯并[a]芘、菲的K1平均值分别为0.44、0.36，K2平均值分别为0.0016、0.0030，BCF平均值分别为268.18、118.57。K1、BCF均随苯并[a]芘、菲暴露浓度的增大而减少。陈辉辉等[22]研究了PAHs对唐鱼的急性毒性效应，发现菲和萘对唐鱼96 h的LC50分别为0.913 mg·L-1和10.849 mg·L-1，其安全质量浓度分别为0.091 mg·L-1和1.085 mg·L-1。本研究表明，14 d内鲍鱼体内吸收9,10-甲基蒽和3-甲基菲的浓度最大可达960.3 μg·L-1和600 μg·L-1，随着PAHs浓度的增加，鲍鱼对2种PAHs的生物富集量逐渐增加。鲍鱼体内PAHs含量在前期增加迅速，随后增加趋于平衡。与高萍等[23]对菲律宾蛤仔对石油烃的富集与释放特征的研究一致。究其原因，生物体对有机污染物的吸收主要取决于其生物体体内脂肪与水体中有机物的比例[24-26]。实验开始时鲍鱼体内PAHs含量比较低，生物体开始大量吸收PAHs，污染物主要由水相向有机相迁移，即生物体体内脂肪对PAHs的吸附起主要作用，此时吸附速率K1高于释放速率K2。经过一段时间富集以后，鲍鱼体内PAHs逐渐趋于饱和，富集增加幅度减小。

与母体多环芳烃相比，烷基多环芳烃具有种类繁多，持久性更强的特点。在受石油污染的环境中，水生生物体内的烷基多环芳烃含量远远高于非烷基多环芳烃。在瓦德兹溢油事件中，当海水青鳉(Oryziasmelastigma)暴露在含有高浓度的烷基化合物中，死亡率、畸形率都明显升高，说明烷基化合物对早期幼鱼的发育影响占有主要地位[27]。

实验由于使用了丙酮作为助溶剂提高了2种PAHs的水溶性，因此生物富集能力可能得到了进一步加强。鲍鱼较其他水生生物相比，富集系数从大到小为：三疣梭子蟹>圆海鰺≈棱鲻≈鲍鱼>鲈鱼>河蚬[28-29]。鲍鱼富集系数在1.05～19.21之间，属于低富集能力，低代谢能力的生物，鲍鱼对于多环芳烃富集系数随时间和浓度呈指数增长。Cmax的范围是75.7～960.3 μg·L-1，说明在不同PAHs浓度下生物体内达到富集平衡时的浓度是不同的。半衰期的不同也说明鲍鱼对PAHs的代谢程度。由此推断，在低浓度PAHs污染海域的鲍鱼受到的影响可能并不严重。但如果是高浓度PAHs污染海域，鲍鱼富集能力增强，且难以代谢，可能造成严重的后果。建议海洋环境管理部门加强对海洋环境中的16种优先监测PAHs的监测，及时对养殖环境质量状况做出评价和预警；同时应加强入海排污总量的管理，严格控制石油类污染物的排放量，保护海洋环境特别是海珍品如鲍鱼、海参、扇贝等养殖区水环境。

表2 文献中水生生物对PAHs的生物富集系数Table 2 Literature data on BCF of PAHs for various aquatic organisms