海洋硅藻细胞表面物理化学特性对镉累积的影响

马捷，陈丰源，周贝贝，段丹丹，韦阳，潘科

深圳大学高等研究院，深圳 518060

硅藻是海洋浮游植物的主要类群，也是海洋生态系统中的重要初级生产者。硅藻具有种类多、数量大、繁殖快等特点，其生物量可占海洋浮游植物的50%以上[1]。硅藻在真光层中吸收二氧化碳和营养盐，通过沉降作用向深海输出生源要素，在海洋生态系统的物质循环和能量流动过程中扮演重要角色[2-3]。

图1 浮游植物吸收痕量金属的过程注：MZ+为自由金属离子；ML为溶液中的金属络合物；M-X为细胞表面的金属络合物；kf，kf’为细胞表面金属络合物的生成速率常数；kd，kd’为细胞表面金属络合物的解离速率常数；kint为金属跨膜运输的速率常数；DML，DMZ+分别为溶液中金属络合物和自由金属离子到达细胞表面扩散层的扩散系数。[8]Fig. 1 The process of the trace metal accumulation by phytoplanktonNote: MZ+ stands for free metal ion; ML stands for metal complex in solution; M-X stands for metal complex on the cell surface; kf, kf’ stand for rate constant for the formation of the metal complex in cell surface; kd, kd’ stand for rate constant for the dissociation of the metal complex in cell surface; kint stands for rate constant of metal across the membrane; DML, DMZ+ stands for diffusion coefficient for the diffusing of the metal complex and free metal ion to the cell surface diffusion layer. [8]

此外，硅藻在Cd的生物地球化学循环中同样发挥了关键的作用[4]。一方面，硅藻中的Cd可以通过食物链一步步富集，最终对人体健康产生危害[5]；另一方面，在缺乏痕量金属的大洋区域，硅藻可利用Cd代替锌(Zn)作为碳酸酐酶中的辅因子来催化二氧化碳的水化反应[6-7]，这一过程对碳循环具有重要意义。因此，研究海洋硅藻吸收Cd的过程，不仅有利于深入了解Cd在海洋生态系统中的迁移规律，而且有利于厘清硅藻在Zn限制条件下的适应性机制。本文从硅藻累积Cd的过程出发，分析环境因子对硅藻细胞表面形貌及其物理化学特性的影响，讨论硅藻细胞表面特征与其吸附Cd之关系，为了解硅藻吸收金属的机制提供新思路。

1 浮游植物吸收痕量金属的过程(The process of the trace metal accumulation by phytoplankton)

浮游植物吸收痕量金属的过程可以分为以下4步：(1)溶液中的金属离子扩散至细胞表面附近；(2)金属离子进入细胞粘液层或细胞壁；(3)金属离子被吸附到细胞壁或细胞膜的结合位点；(4)金属离子缓慢且不可逆地跨越细胞膜，被转运至细胞内，并与胞内不同的组分结合[8](图1)。可见，浮游植物吸收重金属的过程既涉及水环境化学，又与生物过程密不可分。任何影响上述步骤的因子均会改变浮游植物吸收重金属的速率。

海水中的重金属离子或以自由离子的形态存在，或与无机配体或有机配体结合，或吸附于不同颗粒物表面。大量的研究表明，水体中痕量金属的生物可利用性或毒性主要取决于自由态金属离子的浓度，而不是水中金属的总浓度。早期研究从多个方面揭示了水化学因子对藻类吸收重金属的影响。溶解性有机碳(DOC)可以有效降低金属的自由离子浓度，减少藻类对金属的累积[9-11]。在淡水环境中，pH是影响藻类累积重金属的主要因素。pH低时，环境中H+会与金属离子竞争藻类细胞表面的吸附位点；反之pH过高时，金属离子会生成不溶性的氢氧化物；在pH为4～8范围内，藻类对大部分金属离子的吸附能力较强[12-13]。海水的pH范围一般稳定在8.0左右，因而海洋藻类对金属有较强的吸附效应。此外，水体中离子强度也会影响金属离子的可利用性。研究表明，当海水盐度从5‰升高到25‰时，Hg、Cd、Cu、Zn、Ni、Pb等金属的自由离子浓度会显著降低，毒性也随之下降[14-15]。

早期的研究多数强调环境理化因子对浮游植物吸收重金属的直接作用，往往较少关注理化因子所引致的生物效应对吸收过程的影响。实际上，环境因子不但会影响金属的生物可利用性，而且会改变浮游植物的生理生化特征，间接作用于金属的累积过程。例如，光照和温度会改变水体中自由离子(free ion)的浓度。增加光强或光照时间可促进络合态铁的解离，使铁的生物有效性提高[16]。另一方面，光照、温度和营养盐会影响浮游植物的生化成分、蛋白活性和生物有效体积[17]。即，环境可以通过调节浮游植物的生长间接影响浮游植物吸收金属的过程[18]。Wang和Dei[19]通过改变营养盐浓度来控制硅藻(Thalassiosirapseudonana)的生长，他们发现硅藻的生长速率与Cd、Se、Zn的吸收速率成正比。类似的生长-吸收关系同样见于自然海域。Luoma等[20]观察到旧金山湾的颗粒Cd和颗粒Zn浓度在春季水华时期会大幅增加。浮游植物的Cd含量似乎与其粒径呈正比。Cullen等[21]发现浮游植物的粒径越大，其细胞内的Cd浓度越高。与此相似，西太平洋真光层中悬浮有机颗粒物的粒径也与颗粒Cd浓度正相关[22]。然而，这种现象背后的机制仍未清楚。一种推测是环境因子改变了浮游植物细胞大小，从而影响了它们吸附金属的能力。有趣的是，Miao等[23]研究发现，T.pseudonana吸收Cd的速率与藻类细胞大小、光合作用活动、细胞周期并无直接联系。这意味着细胞大小不是环境因子调控硅藻吸收Cd的唯一机制。

由上可见，浮游植物吸收重金属是一个受多因素制约的复杂过程。理解这一过程不但要分析水中金属离子的化学形态特征，而且要研究相应条件下浮游植物生理状态。在金属离子进入藻类细胞内部之前，金属离子会首先与藻类表面的各类生物分子结合。这一生物吸附过程很大程度制约了金属的内化速率。藻类细胞的表面物理化学特性如何影响其吸附金属的能力，尚有待深入研究予以揭示。

2 多变的硅藻细胞表面形貌及其物理化学特性(The diversity of surface morphology for diatoms and their physicochemical properties)

除了隐藻、裸藻和金藻，大部分浮游植物细胞外层都包覆有细胞壁。浮游植物的细胞壁形态各异，通常分为内外两层。例如绿藻细胞壁的外层为果胶质，内层为纤维质。而硅藻的细胞壁较为特殊，主要由硅质(SiO2·nH2O)外壳和果胶质内层组成[24]。硅质壳(frustule)分为上下2个壳面，它们形态相似，大小不等，相互套合，形如培养皿。硅藻外形及纹理通常具有规律性[25]。硅质壳的物理化学性质接近于石英玻璃。Hamm等[26]发现羽纹纲硅藻壳体肋部和环带可分别承受约680和330 MPa的压力而不被破坏。此外，硅质壳外包裹了一层由多糖和蛋白组成的有机被膜(organic coating)。被膜富含羧基、氨基和硅醇基等基团，为各种金属离子提供了丰富的结合位点[27]。

硅藻的表面形貌结构具有一定的可塑性。当光照强度、温度、营养盐水平、pH、盐度、捕食压力、污染物浓度等因子改变时，硅藻细胞的大小、细胞壁的轮廓和纹理、以及细胞壁的组分均可发生变化[28]。例如，弱光照会导致膨胀海链藻(Thalassiosiratumida)细胞壳面直径的显著减小[29]。此外，硅藻的形态特征与温度密切相关。Montagnes和Franklin[30]发现，水温每升高一摄氏度，硅藻的细胞体积会降低约4%。当水体的pH值过高或过低时，硅藻细胞壳面轮廓会发生变形[31]。当硅藻的生长受到N、P和Si等营养元素限制时，其体积和表面积会同时缩小[32]。此外，Cu、Zn和Cd等金属的毒性效应会造成硅藻细胞畸变。例如0.2 mmol L-1的Cd能引起三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)表面出现类似螺旋的微观结构[33]。可见，环境因子很大程度上影响了硅藻形态特征。究其原因，是环境因子改变了硅藻细胞的光合作用活性[34]和细胞组分[35]，又或抑制了营养盐的吸收[36]和相关蛋白质的合成[37-38]，从而间接影响细胞的生理状态，包括细胞壁的生长和细胞的表面物理化学特性。

值得注意的是，这些微观结构的变化很可能会影响硅藻吸收利用金属的能力。首先，细胞大小的变化会改变细胞的比表面积，而细胞的比表面积是影响藻类吸收痕量金属的关键因素[39]。再者，当环境因子改变时，细胞表面的物理化学属性，例如表面粗糙度、表面电荷密度，或者官能团的种类和数量会发生改变，从而影响硅藻对金属离子的吸附[40-41]。早期的研究主要利用光学显微镜和电子显微镜对硅藻的表面形貌进行定性描述，鲜有研究定量地测定环境因子如何影响硅藻的微观特性，例如表面粗糙度和表面电势。随着技术的发展，我们可以利用原子力显微镜技术(Atomic Force Microscopy, AFM)定量测定细胞表面细微结构的各种物理特性(粗糙度、表面电势、弹性、硬度、摩擦力等)。与其他显微技术(如荧光显微镜和电子显微镜等)不同，AFM对制样的要求很少，无需进行染色或包裹处理。它可以直接获得生物样品(例如细胞、蛋白或DNA分子)的三维表面形貌和表面物理特性，可最大程度地反映硅藻的自然表面特性。借助于AFM技术，我们可以深入研究不同环境条件下硅藻表面物理特性与其吸附金属之间的关系。

3 硅藻细胞表面物理化学特性与Cd累积之关系(The relationship between the physicochemical properties of diatom cell surface and Cd accumulation)

硅藻吸附Cd是一个发生在细胞表面固液界面的复杂物理、化学与生物过程。硅藻细胞的表面物理化学特性(粗糙度、粘附力、基团的种类和数量)直接影响了细胞表面与水溶液中的金属离子的相互作用，从而改变了金属离子在藻细胞中的内化速率[39-44]。

3.1 硅藻表面粗糙度与镉吸附

显而易见，硅藻表面的粗糙度首先反映了细胞表面积的大小。粗糙度越大细胞接触水体的面积越大。但目前较少研究以表面粗糙度来定量描述藻类的表面特征。Henke等[45]利用AFM测量了二氧化硅基片的粗糙度。他们发现基片的粗糙度越大，比表面积就越大，基片能共价结合的有机基团就越多。换而言之，基片能提供的金属离子结合位点会大大增加。藻类细胞的表面粗糙度会随环境而变。Vrieling等[46]发现，低盐度下威氏海链藻(T.weissflogii)的细胞表面粗糙度会增加。这是因为低盐度会导致硅藻细胞表面形成粒径更小、结构更为致密的纳米二氧化硅结构。我们在研究中也有类似发现。当盐度从32‰降低到18‰后，新月菱形藻(Nitzschiaclosterium)的细胞表面粗糙度显著增加，而且单位细胞面积吸附Cd更多(图2，Ma等，待发表数据)。营养盐供应同样会影响硅藻的表面粗糙度，例如缺硅会造成硅藻细胞壁形成缺陷区域而增加细胞表面粗糙度。有趣的是，缺硅细胞吸附Cd的能力不升反降。深入研究后发现，虽然缺硅细胞的表面积增大，但其表面的功能基团的种类和数量同时改变(见下)，其总效应为硅藻细胞吸附Cd的能力下降。

图2 低盐度(18 psu)和高盐度(32 psu)条件下硅藻(Nitzschia closterium)细胞的形貌、表面粗糙度的原子力显微镜(AFM)示意图注：(a)低盐度条件下的细胞表面AFM形貌图，(b)为(a)中红框部分放大的3D形貌图；(c, d)对应的高盐度条件下的细胞AFM图像；由(b, d)可见低盐度和高盐度条件下细胞的表面粗糙度存在显著差异(数据来自Ma等，待发表数据)。Fig. 2 Atomic Force Microscopy (AFM) images of N. closterium cells acclimated at 18 and 32 psuNote: (a and c) AFM 3D images showing the representative morphology of the diatom cells. (b and d) Amplified 3D morphology of typical difference in roughness in 2 × 2 μm (amplified the square frame area in red) area on the cell walls of cells cultivated at salinities of 18 and 32 psu, respectively (Ma et al., in press).

图3 不同盐度(18, 32 psu)或硅浓度(Low-, High-Si)条件下硅藻(Nitzschia closterium)细胞表面电势的原子力显微镜示意图注：(a)低盐度条件下的细胞表面AFM形貌(上)和电势(下)图，(b)为对应高盐度的细胞图；(c, d)低硅和高硅条件下的细胞图像。由电势图像可见盐度和硅营养条件都会影响细胞的表面电势(数据来自Ma等，待发表数据)。Fig. 3 AFM morphology (up) and surface potential (down) images of N. closterium cells acclimated at 18 and 32 psu, or Low- and High- silicon conditionsNote: (a) Representative AFM potential images of the diatom cells acclimated at 18 psu; (b) Corresponding potential images of the diatom cells acclimated at 32 psu; (c and d) Representative morphology and potential images of the diatom cells acclimated at Low- and High-Si conditions. Both salinity and silicon level can influence the cell surface potential. (Ma et al., in press).

3.2 硅藻表面功能基团与镉吸附

硅藻的表面功能基团是影响硅藻吸附金属的另外一个重要因素。硅藻细胞壁主要由肽聚糖、多糖、脂质和蛋白构成。这些组分中的羧基、氨基、硅醇基和巯基等功能基团带有负电，对吸附金属离子起关键作用[35]。从元素构成来看，新月菱形藻(N.closterium)细胞壁上的C和O可占到细胞壁的80%以上，而Si和N元素也可占到5%～15%，P和S元素所占的比例则在2%左右，其他元素通常情况下所占比例低于1%[47]。作为一种软金属离子，理论上Cd更易于与硫醇等含硫的基团结合。但硅藻细胞壁的S原子比较低，因此硫醇基团在吸附Cd的过程中所起的作用有限。我们认为，对硅藻细胞壁吸附Cd起决定性作用的，主要还是C、O、Si、N等元素构成的功能基团[48]。

通过X射线光电子能谱(XPS)研究发现，硅藻细胞表面功能基团的组成和比例会随环境条件而变。当环境中Si缺乏时，N.closterium细胞壁的Si原子比会显著下降(从19.2%降至4.5%)。同时，细胞壁Si的形态也会发生明显变化——二氧化硅的比例下降，而低密度无定形硅酸的比例上升。这一系列变化的最终结果是细胞表面SiO-基团密度减少，降低了细胞壁吸附Cd的能力[47]。大量研究表明，盐度对藻类吸收金属离子具有显著的调控作用。低盐度会促进藻类对金属离子的吸收，并引起更强的金属毒性效应。这是因为在相同金属浓度下，盐度越低，自由金属离子的比例越高。盐度变化并不会导致新月菱形藻细胞壁Si含量产生变化。然而，盐度从32 psu降低到18 psu时，硅藻(P.tricornutum和N.closterium)细胞壁的Si多以SiO-的形式存在。而且低盐度时O:C的比例升高，这说明含O的负电基团(例如羧基)等增多；此外，低盐度下S的原子比也会显著升高，表明细胞壁中含硫基团的数量有所提升，这对提高细胞对Cd的亲和力具有重要作用(Ma等, 待发表数据)。

3.3 硅藻的表面电势与镉吸附

细胞的表面基团的种类和数量决定了其表面电势。后者直接决定了藻细胞对金属离子的吸附能力。Gélabert等[39]通过电泳迁移率的方法测定了硅藻表面电势，他们发现硅藻表面的羧基和硅醇基团在吸附Zn的过程中起到了主要作用。进一步的研究表明，羧基的电负性比羰基和硅醇基等基团更强，富含羧基的细胞壁极性更高，因而能吸附更多的Zn和Cd[49]。然而，这些研究均以细胞群体作为测量对象，没有原位测量藻类单细胞的表面电势，缺乏细胞表面结构-电化学性质之间直接关联的证据。而AFM可以在单个细胞或者分子上同时原位探测生物(分子)表面结构和电势，为深入了解藻类表面物理化学特性铺开了道路。

目前有关环境因子对硅藻细胞表面电势的影响研究几近空白。已有一些研究者使用AFM研究外界刺激对动物细胞表面电势的影响。Tsai等[50]利用开尔文探针力显微镜(KPFM)测量了小鼠肿瘤细胞表面电势。结果发现，经过H2O2和Zn离子预处理的细胞表面电势更高，这一结果为进一步借助KPFM研究环境因子对硅藻表面电势的影响提供了经验。我们的初步研究结果显示，低盐度或者高Si条件下培养的硅藻(N.closterium)细胞的表面电势更低(图3，待发表数据)。结合上述XPS结果可知，这是由细胞表面更多带负电荷功能基团引起的。

细胞表面电势的变化最终会影响硅藻细胞吸收Cd的速率。Yang等[51]利用非损伤微测技术(NMT)测量了硅藻(Cylindrothecasp.)表面的Ca离子流。发现细胞表面电势减弱后，Ca离子的外排速率加快。有趣的是，Ma等[52]报道，水稻悬浮细胞的表面电势在Si限制条件下更弱，但其吸收Cd的速率却较高。NMT能反映出细胞表面电势差与离子流速之间的关系，这使它成为了一种研究细胞生物学和生理学极为有效的工具[53]。但目前为止，针对藻类单细胞表面Cd离子流的研究却非常匮乏。

综上所述，硅藻累积Cd的动力学过程与碳等关键生源要素的生物地球化学循环密切相关。环境条件(盐度、营养盐、pH、光照、温度)会影响硅藻累积Cd，但其背后的调控机制有待我们进一步挖掘。已有的研究表明，硅藻细胞的表面形貌在不同环境条件下有较大变化。这些变化包括了直观可见的细胞表面结构的改变，也包括了潜在的物理特性转变。重要的是，这些微观的变化可能对Cd的内化与转运过程产生深远的影响。环境因子如何影响硅藻细胞的表面物理特性，并作用于硅藻累积Cd的关键过程，均有待系统阐明。环境因子会改变硅藻细胞表面的粗糙度和表面电势，影响硅藻细胞吸附Cd的能力和Cd的内化速率，并最终影响硅藻细胞的Cd含量。未来采用多学科交叉的研究思路，从机理上对上述问题进行深入的剖析和探讨，研究环境因子-硅藻表面物化特性与硅藻吸收Cd过程之关系，从而拓展我们对硅藻吸收利用痕量金属的认识。