镉对单环刺螠非特异性免疫及组织蓄积的影响

朱晓莹，甘宏涛，孟霄，姚海洋，徐国成1,，徐加涛，刘统昊，曹黎鑫，许星鸿1,,*

1. 江苏省海洋生物资源与环境重点实验室，淮海工学院，连云港 222005 2. 淮海工学院 海洋生命与水产学院，连云港 222005

重金属镉(Cd)是一种极易蓄积且半衰期长的有毒污染物，会对生物体的免疫和生殖系统造成损伤，还具有致癌、致畸等作用[1]。近年来随着工农业生产的发展，水环境中的Cd污染程度也日益严重，不但会影响水生生物的生理机能，还会通过食物链富集对人体健康构成威胁。单环刺螠(Urechisunicinctus)分布于黄、渤海泥沙岸潮间带及潮下带，其富含必需氨基酸、不饱和脂肪酸和微量元素，提取物有一定抗肿瘤和提高免疫力的作用，具有较高的经济价值和良好的开发利用前景[2]。目前对单环刺螠的研究主要集中于纤溶酶的分离纯化和溶栓作用，以及对硫化物的应激代谢等方面[3-4]，而重金属对单环刺螠的毒性报道很少，仅见唐永政等[5]检测了3种重金属离子(Cu2+、Hg2+、Cd2+)对幼螠的急性毒性。本文研究了单环刺螠在不同质量浓度Cd胁迫下，其免疫相关指标及组织中Cd蓄积量的变化规律，旨在探讨Cd对单环刺螠的毒性效应，为养殖水质调控及海洋环境监测提供参考。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 材料

实验用单环刺螠于2017年12月购自连云港市水产品市场，平均体长为(12.1±1.5) cm，平均体质量为(21.2±4.2) g，于实验室暂养7 d后进行实验。暂养条件为：盐度25，pH 8，水温(15±1) ℃，自然光照，连续充气，日投喂1次小球藻(Chlorellapacifica)，藻液密度104mL-1，投喂量10 mL·L-1，实验所用海水均用曝气自来水和海水晶配制，经检测其Cd含量为0.001 mg·L-1，为实验用海水本底。选择大小相近、体表无损伤及活力强者用于实验。

1.2 实验设计

根据国家《渔业水质标准》(GB11607—1989)[6](Cd质量浓度≤0.005 mg·L-1)及海水中Cd通常的污染浓度[7]，本实验Cd质量浓度设置为对照组0.005 mg·L-1、0.05 mg·L-1和0.5 mg·L-1，用氯化镉(分析纯，国药集团药业股份有限公司)配制的1 g·L-1原液调节各处理组Cd浓度。每组设3个平行，每个平行随机放40条单环刺螠，于50 cm×60 cm×60 cm养殖箱中饲养，养殖条件与暂养时相同，每日定时换水1次，每次换水50%，并维持各组氯化镉质量浓度。实验期间不喂食，以消除饵料的影响。于处理0、3、6、12、24、48、72和96 h，每组随机取3条单环刺螠，解剖取其血液，保留一部分全血用于测定血细胞密度，另一部分于4 ℃、12 000 r·min-1离心5 min，取上清液即血清，-80 ℃保存，用于测定免疫相关指标。于实验5、10、15 d，每组取3条单环刺螠，解剖取其肌肉和消化道，-80 ℃保存，用于检测组织中Cd蓄积量。

1.3 检测方法

免疫相关指标选用血细胞密度(density of hemocyte, DHC)、血清总蛋白含量，酚氧化酶(phenoloxidase, PO)、溶菌酶(lysozyme, LSZ)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活力，过氧化氢(H2O2)和丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量。将抽取的一部分血液按1:1比例与柠檬酸葡萄糖(acid citrate dextrose, ACD)抗凝剂充分混匀，用血球计数板(上海市求精生化试剂仪器有限公司，规格为16×25格)计数，然后按照文献[8]计算血细胞密度。血清中总蛋白含量采用双缩脲试剂法，以牛血清蛋白为标准，用T6紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)于540 nm进行比色测定[9]。PO和LSZ活力分别采用Ashida[10]、Hultmark等[11]方法进行测定。SOD活力、过氧化氢(H2O2)和MDA含量分别参照南京建成生物工程研究所的H2O2和MDA测试盒说明进行测定。取肌肉和消化道2种组织经湿法消化(V(HNO3)∶V(HClO4)=2∶1)，1% HNO3溶解，过滤，定容至25 mL，采用全谱直读电感耦合等离子体原子发射光谱仪(美国Thermo fisher iCAP 6300型，检出限为ppb级)测定Cd含量。

1.4 数据分析

实验数据以“平均数±标准差”表示，采用SPSS18.0软件进行单因子方差分析，LSD多重比较和Duncan检验，显著水平设为0.05。

图1 Cd胁迫对单环刺螠血细胞密度(DHC)和血清总蛋白含量的影响注：上标不同小写字母的数值表示同一测试时间不同处理组间差异显著(P<0.05，余同)。Fig. 1 Effect of Cd stress on the density of hemocyte (DHC) and the total protein content in serum of Urechis unicinctusNote: The values of different lowercase letters in the superscript indicate that the differences between the groups are significant at the same test time (P<0.05, the same below).

2 结果(Results)

2.1 Cd胁迫对单环刺螠血细胞密度和血清总蛋白含量的影响

如图1所示，在Cd胁迫下，处理组血细胞密度(DHC)总体呈“先升后降再升”的趋势。处理3 h，处理组DHC均显著升高，以低浓度组DHC上升较快，在胁迫24 h时升至最大值。处理至96 h，处理组DHC均显著高于对照组(P<0.05)，呈显著的时间-剂量-效应关系(P<0.05)，而各实验组总蛋白含量变化不显著(P>0.05)。

2.2 Cd胁迫对单环刺螠血清中PO和LSZ活力的影响

从图2可以看出，各处理组PO活力总体呈先升后降的趋势。PO活力以较高胁迫浓度组(0.05 mg·L-1和0.5 mg·L-1)上升较快，于处理24 h且升高幅度较大。0.005 mg·L-1组于48 h达到最大值，随后逐渐下降。至处理96 h，0.05 mg·L-1和0.5 mg·L-1两组PO活力显著低于对照组和0.005 mg·L-1组(P<0.05)；在实验期间，随胁迫时间延长，0.005 mg·L-1组PO活力没有明显时间-剂量-效应关系，而0.05 mg·L-1和0.5 mg·L-1两组PO活力在3～24 h内与胁迫时间和Cd质量浓度显著正相关(P<0.05)，在24～96 h内为显著负相关(P<0.05)。

Cd胁迫下，LSZ活力呈先降后升再降的趋势。处理3 h，各处理组LSZ活力均出现显著下降，以较高胁迫浓度组(0.05 mg·L-1和0.5 mg·L-1)下降幅度较大，于处理6 h出现明显回升。随着胁迫时间延长，处理组LSZ活力在回升后又呈下降趋势。处理72 h后，各处理组LSZ活力均显著低于对照组(P<0.05)，在实验期间，各处理组LSZ活力有波动，没有明显的时间-剂量-效应关系。

2.3 Cd胁迫对单环刺螠血清中SOD活力的影响

Cd胁迫对单环刺螠血清中SOD活力的影响如图3所示。随胁迫时间延长，各处理组SOD活力总体呈缓慢上升趋势，除处理3 h的0.005 mg·L-1组以外，其他各处理组SOD活力均高于对照组，且在实验期间，SOD活力与胁迫时间呈显著的时间-效应关系(P<0.05)，而与Cd质量浓度没有显著的剂量-效应关系(P>0.05)。

图2 Cd胁迫对单环刺螠血清中酚氧化酶(PO)和溶菌酶(LSZ)活力的影响Fig. 2 Effect of cadmium stress on the activity of phenoloxidase (PO) and lysozyme (LSZ) in serum of Urechis unicinctus

图3 Cd胁迫对单环刺螠血清中超氧化物歧化酶(SOD)活力的影响Fig. 3 Effect of cadmium stress on the activity of superoxide dismutase (SOD) in serum of Urechis unicinctus

图4 Cd胁迫对单环刺螠血清中H2O2和丙二醛(MDA)含量的影响Fig. 4 Effect of cadmium stress on the content of H2O2 and malondialdehyde (MDA) in serum of Urechis unicinctus

2.4 Cd胁迫对单环刺螠血清中H2O2和MDA含量的影响

由图4可见，各处理组H2O2含量呈先升后降再升的趋势。H2O2含量于暴露6 h升到最大值，且存在显著的剂量-时间-效应关系；随后又快速下降，于12 h降至最低，均低于对照组，随后又逐渐上升。至96 h时，各处理组H2O2含量均高于对照组。Cd胁迫下，处理组MDA含量总体呈缓慢上升趋势，至96 h，各处理组MDA含量显著高于对照组(P<0.05)，且在3～6 h内，MDA含量与胁迫时间和Cd质量浓度显著正相关(P<0.05)，在72～96 h则显著负相关(P<0.05)。

2.5 Cd胁迫对单环刺螠组织蓄积的影响

如图5所示，随Cd暴露时间延长，各处理组单环刺螠体壁肌肉和消化道中Cd含量均呈上升趋势，且存在显著的剂量-浓度效应关系(P<0.05)。Cd在单环刺螠机体的蓄积具有组织特异性，消化道中的蓄积量显著多于体壁肌肉(P<0.05)。

3 讨论(Discussion)

3.1 Cd胁迫对单环刺螠非特异性免疫的影响

有研究表明环境变化会对血细胞数量产生显著影响，水生动物DHC常作为生物体免疫状态的衡量指标[12]。拟穴青蟹(Scyllaparamamo)在不同浓度(0.0025、0.05、0.075和0.1 mg·L-1) Cd胁迫后，短时间内DHC显著降低，表现出剂量-效应关系，胁迫至9 d后，较低浓度(0.0025和0.05 mg·L-1)处理组DHC恢复至对照组水平[13]。长臂虾(Palaemonelegans)经Cd暴露后8 h，其DHC显著下降，而后又逐渐升高[14]。本研究中，Cd胁迫96 h后，单环刺螠DHC各处理组均显著高于对照组，且存在一定的剂量-效应关系，与上述研究结果相近。表明生物体对Cd胁迫具有一定的适应性，在胁迫浓度较低时，对机体的毒害作用较小，较高胁迫浓度则会引起明显的应激反应，DHC显著变化，而且不同水生动物对Cd胁迫的响应存在差异。

Zahedi等[15]将波斯鲟(Acipenserpersicus)幼体暴露于0.68 mg·L-1的Cd中14 d，鱼体血清总蛋白含量无显著变化；将鲢鱼(Hypophthalmichthysmolitrix)置于0.01 mg·L-1的Cd中胁迫96 h，其血清总蛋白含量变化不明显[16]，与本研究结果一致，表明Cd胁迫对机体血清总蛋白含量可能影响不大。

PO是水生无脊椎动物非特异性免疫防御系统中的重要成员[17]。秦圣娟等[18]报道，随着Cd浓度增大，长江华溪蟹(Sinopotamonyangtsekiense)血清中PO活力总体呈现先升后降的变化趋势，与本研究结果一致。表明PO对金属离子较为敏感，在机体受到环境中重金属离子的胁迫时，免疫系统中PO被诱导产生，以防御外界环境胁迫对机体的损伤。而在长时间的较高浓度Cd胁迫下，免疫机能受到影响，所以出现随暴露时间延长，PO活力逐渐下降的现象。

图5 Cd胁迫对单环刺螠肌肉和消化道中Cd蓄积量的影响Fig. 5 Effects of cadmium stress on the cadmium accumulation of the muscle and the digestive tract of Urechis unicinctus

LSZ是体液免疫中重要成分之一，Cd会和溶菌酶的活性位点直接结合，改变其结构和功能，且不同浓度的Cd与溶菌酶的结合能力不同，因而对酶活性也会有不同程度的影响[19]。李慧等[20]研究发现0.05和0.5 mg·L-1的Cd可引起鲤鱼(Cyprinuscarpio)血清中LSZ活力显著升高；王志和武二栓[21]研究表明鲤鱼血清中LSZ含量随Cd浓度增加而升高，且高浓度组显著高于对照组。本研究中，单环刺螠LSZ活力在Cd胁迫下总体呈先升后降的趋势，至胁迫72 h后，各处理组LSZ活力均显著低于对照组，表明Cd胁迫对单环刺螠的抗菌能力影响较大，不同生物体应对Cd胁迫的免疫机制亦不同。

3.2 Cd胁迫对单环刺螠抗氧化能力的影响

正常情况下，生物体内产生的H2O2等成分会被抗氧化系统中相关酶清除，维持机体正常的生命活动，而当机体受到环境因子胁迫时，其含量会发生变化。研究表明，Cd会抑制机体内抗氧化相关酶的活性，促使H2O2含量增加，诱发氧化损伤、细胞凋亡等过程[26]。Wang等[27]研究表明淡水蟹(Sinopotamonhenanense)在暴露于浓度为58 mg·L-1的Cd后，与对照组相比，鳃中H2O2含量在2～4 h显著增加，8 h后逐渐下降，处理24～48 h后再次增加。薛蓓等[28]发现脊尾白虾(Palaemoncarincauda)暴露于Cd后，0.005 mmol·L-1组在短时间内H2O2含量变化比其他处理组更明显，胁迫至24 h后，各实验组与对照组均不存在显著性差异。本研究中，各处理组H2O2含量于6 h时达到最大值，且差异显著；随后快速下降，于12 h降至最低，均低于对照组；96 h时，各处理组H2O2含量均高于对照组，且各处理组间差异不显著。表明单环刺螠在受到Cd短期胁迫后，其体内产生的大量H2O2得不到及时清除而积聚在体内，致使其含量迅速上升，Cd浓度越高，单环刺螠体内的H2O2含量相对越高；而随胁迫时间延长，各处理组的H2O2含量逐渐下降，是由于机体受到Cd胁迫后诱导体内的抗氧化系统产生相关酶，使体内过剩的H2O2被及时清除。

MDA是由自由基与生物膜中的脂类形成的过氧化产物，可通过MDA的含量反映膜脂过氧化程度及膜系统的受损程度。0.005 mmol·L-1浓度的Cd暴露后，脊尾白虾MDA含量快速上升，于9 h时达到最大值，且显著高于对照组及其他各处理组，随后又逐渐下降，而较低浓度(0.001和0.002 mmol·L-1)组MDA的含量变化则相对缓慢[28]。本研究中，0.005和0.05 mg·L-1浓度组MDA含量总体呈缓慢上升趋势，而0.5 mg·L-1浓度组则先升高后降低。这与上述研究结果相似。这可能是单环刺螠在短时间内受到较高浓度Cd胁迫后，机体内产生过多的自由基成分未及时清除而使脂质过氧化过程加剧，MDA含量增加；随胁迫时间的延长，单环刺螠体内诱导产生了抗氧化相关酶，清除了机体内过剩的自由基成分，MDA含量相应下降。

综上所述，Cd胁迫会刺激机体产生自由基和H2O2等成分，进入体内的Cd首先可能通过诱导合成大量非特异性免疫机制中的PO、LSZ等一些酶类以及金属硫蛋白基因的大量表达，进行结合进入体内多余的Cd2+，起到暂时解毒的作用，其次会诱导抗氧化机制中的SOD等抗氧化酶成分，用于清除体内过剩的氧自由基、H2O2等成分，H2O2含量则会快速下降；当胁迫时间过长时，体内进入过多的Cd，超出了免疫系统中的酶类可以结合的上限，多余的Cd会持续刺激机体产生大量氧自由基、H2O2等成分，与生物膜中的脂类形成的过氧化产物MDA，故MDA会持续增加。因此MDA含量可作为单环刺螠在Cd环境中长期胁迫后的免疫检测指标。

3.3 Cd胁迫对单环刺螠组织蓄积的影响

相关研究表明，水生生物对重金属Cd的蓄积具有组织特异性[29-30]。于淑池等[31]报道波纹巴非蛤(Paphiaundulata)于安全浓度下(0.02767 mg·L-1)下胁迫120 h，其体内Cd的蓄积量水平依次为内脏团>鳃>肌肉；Charan-Dixon等[32]用质量浓度分别为15 μg·L-1、765 μg·L-1的Cd胁迫海参(Australostichopusmollis)，结果表明其呼吸肠中Cd的蓄积量高于体壁肌肉；张林宝等[25]研究表明菲律宾蛤仔肝胰腺与鳃的Cd蓄积量随Cd浓度与暴露时间的增加而增大。本实验中，单环刺螠用不同质量浓度(0.005、0.05和0.5 mg·L-1)的Cd胁迫5 d、10 d、15 d后，其消化道Cd的蓄积量显著高于肌肉，且呈现明显的浓度效应和时间效应，与上述报道的结果一致。这可能是因为单环刺螠不同组织对重金属的吸收、代谢及调节能力不同，可直接通过摄食经消化道吸收水体或残留在饵料中的重金属，因而消化道内Cd含量高于肌肉。