pH、氨氮和亚硝酸盐对单环刺螠稚螠耗氧率和排氨率的影响

张赛赛，董美艳，田斌，孙阳，陈颖，周竹君，宋晓阳，杨婷婷，刘彤，陈文博

（1.大连市现代农业生产发展服务中心，辽宁 大连 116023；2.瓦房店市渔业事务服务中心，辽宁 瓦房店 116300）

单环刺螠Urechis unicinctus 俗称海肠，属螠虫动物门Echiuroide、螠纲Echiuride、无管螠目Xenopneusta、刺螠科Urechidae[1]，分布范围较广，如俄罗斯、日本、朝鲜和我国的环渤海沿岸，主要生活在泥沙岸潮间带下区及潮下带浅水区，主要滤食水中有机质和浮游生物。单环刺螠口感鲜美，营养和药用价值高，价格不断攀升，成为我国北方新兴的海水养殖种类。近年来，野生单环刺螠资源明显下降，人工繁育应运而生，相关研究日渐增多。目前对单环刺螠的人工繁育技术[2]、营养成分[3]、基础生物学[4,5]和分子生物学[6,7]等已有较多研究。

耗氧率和排氨率是生物能量代谢的主要指标，能够反映养殖生物对环境的适应性和养殖特性，为人工养殖和生态学研究提供重要的数据支持。水生生物能量代谢受内外两方面因素的影响，即种类、规格、发育阶段等生物自身因素和光照、温度、盐度、pH 等外部环境因素[8]。张志峰等[9]研究了不同硫化物浓度下单环刺螠的呼吸代谢酶类活性的变化；王爱敏等研究了不同氨氮浓度及盐度下单环刺螠的耗氧率[10]；孙涛等研究了不同pH 下单环刺螠耗氧率和排氨率的变化[11]。但是，单环刺螠在pH 和氨氮胁迫下呼吸排泄、规格和氨氮浓度的影响等还有待完善。本研究采用静水密封法，探讨了6 个pH梯度、5 个氨氮和亚硝酸盐浓度下体质量（1.52±0.12）g 的单环刺螠呼吸代谢的适应情况，并为工厂化养殖环境的管理提供数据参考。

1 材料和方法

1.1 材料

试验用单环刺螠系人工繁育培养，带水运输到实验室暂养在底部铺细沙的50 L 塑料方槽内。一周暂养期间，每天上午投喂一次，下午换水1/2，细沙上方悬挂气石，保持溶氧充足。

暂养用海水为经沉淀、砂滤的洁净自然海水，水温14.5～17.0℃，盐度32.17～32.28，pH7.88～8.15，氨氮1.058×10-2～4.338×10-2mg/L，亚硝酸盐1.68×10-3～2.79×10-3mg/L，符合海水水质一类标准。

1.2 方法

实验用容积500 mL 瓶子，每瓶4 只单环刺螠，采用静水密封法测量生物呼吸，1 个空白对照组和3 个实验组。实验处理3 h，开始前后按标准操作取水样。采用《海洋监测规范第4 部分：海水分析GB17378.4-2007》碘量法和次溴酸钠氧化法测定耗氧率和排氨率。

实验用NaOH 和HCL 溶液调配，设5 个pH 梯度（6、7、8、9、10），以相隔10 min 测量两次结果不超过0.05 为稳定pH。暂养1 周后，对单环刺螠稚螠进行pH 驯化后开始实验。根据自然海水和工厂化养殖中可能出现的氨氮和亚硝酸盐浓度设置梯度，使用氯化铵和亚硝酸钠配置的100 g/L 母液配置相应浓度海水后，根据实测浓度为准，设氨氮浓度0.0699 mg/L、0.0736 mg/L、0.1560 mg/L、0.6150 mg/L 和1.0200 mg/L，亚硝酸盐浓度0.0198 mg/L、0.0256 mg/L、0.0502 mg/L、0.0738 mg/L 和0.4960 mg/L。每个梯度设置三个平行和一个空白对照组。

实验设置持续5 h 的耗氧率变化。设置五个实验组，每组三个平行，均使用正常海水，每瓶放置4只单环刺螠，同时开始实验，隔1 h 结束一组，测定实验前后水样中的溶解氧量，计算单环刺螠耗氧率。

1.3 数据计算与处理

采用下式计算耗氧量、耗氧率和排氨量、排氨率：

式中：DO0、DOt分别为实验组起始和t 时的溶解氧量（mg/L）；C0、Ct分别为空白对照组始、末溶氧量（mg/L）；V 为呼吸瓶体积，0.5 L；m 为单环刺螠的体质量（g）；t 为实验持续时间（h）。

RNN是单位体质量排氨量[mg/（g·h）]；N0、Nt表示实验组始、末氨氮含量（mg/L）；CN0、CNt分别为空白对照组始末氨氮含量（mg/L）。

氧氮比O/N=R00/RNN，单环刺螠耗氧与排氨的克原子比值[12]。

能量代谢率M=QOX·OR，式中M 为单环刺螠单位质量的能量代谢率[J/（g·h）]，为氧卡系数，其值采用13.54 J/mg[11]。

实验数据以平均值±标准差表示，用SPSS 20.0统计软件进行ANOVO-单因素方差分析；组间差异用Duncan 法作多重比较；显著水平设置为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 溶解氧量对单环刺螠代谢的影响

单环刺螠在密封呼吸瓶中的耗氧量和耗氧率随时间的变化见图1。由图1 可知：耗氧量和耗氧率随时间的延长而逐渐减少，在前2 h 内，耗氧量和耗氧率缓慢降低，第2～4 h 内，耗氧量和耗氧率快速下降，第4 h 以后，耗氧量和耗氧率下降变化不明显，达到最低值。第1～2 h 的耗氧率差异不显著（P＞0.05），显著高于第3 h、4 h、5 h 的耗氧率（P＜0.05），后两者差异不显著（P＞0.05），显著低于第3 h（P＜0.05）。

图1 单环刺螠耗氧率随时间的变化Fig.1 Changes in oxygen consumption rate of echiuran worm with the time

随时间延长呼吸瓶中氧浓度下降，能量代谢率与耗氧量和耗氧率变化规律有相似的结果，即随时间的增加，能量代谢率总体下降。第1 h 和第2 h、第4 h 和第5 h 的能量代谢率差异不显著（P＞0.05）。第1 h 和第2 h 的能量代谢率显著高于第3 h、4 h 和5 h（P＜0.05）；第3 h 显著高于第1 h 和第5 h（P＜0.05）（图2）。

图2 单环刺螠能量代谢率随时间的变化规律Fig.2 Changes in energy metabolism rate of echiuran worm with the time

2.2 pH 变化对单环刺螠代谢的影响

pH 对单环刺螠耗氧量和耗氧率的影响见图3。由图3 可知，随着pH 升高，耗氧量和耗氧率先升高后降低。当pH 为8 时，耗氧量和耗氧率达到峰值，显著高于pH 为6、7、10（P＜0.05）；pH 为6 时耗氧率显著小于pH 为8、9 时（P＜0.05）；pH 为7、9、10 时，耗氧率差异不显著（P＞0.05）。回归分析显示，单环刺螠pH 和耗氧率两者呈二次多项式关系：Y=-0.008X2+0.0543X-0.0141（R2=0.8833，X=pH，Y=耗氧率）。

图3 pH 对单环刺螠耗氧量和耗氧率的影响Fig.3 Effects of pH on oxygen consumption and oxygen consumption rate of echiuran worm

pH 对单环刺螠排氨量和排氨率的影响见图4。由图4 可知，排氨量和排氨率呈先升高后降低的趋势。当pH 超过7 时，排氨量和排氨率显著减小（P＜0.05）。单环刺螠排氨率与pH 的回归方程为二次多项 式：Y=-0.0002X2+0.0005X+0.0081（R2=0.6287，X表示pH，Y 表示排氨率）。

图4 pH 对单环刺螠排氨量和排氨率的影响Fig.4 Effects of pH value on amount and rate of ammonia excretion of echiuran worm

pH 对单环刺螠氧氮比（O/N）和能量代谢率的影响见图5 和图6。由图5 和图6 可知，氧氮比和能量代谢率呈明显的先升高后降低趋势，当pH=8 时，氧氮比和能量代谢率均达最大值（P＜0.05）。

图5 不同pH 下单环刺螠的氧氮比Fig.5 The oxygen nitrogen ratio（O/N）of echiuran worm exposed to various pH values

图6 不同pH 下单环刺螠的能量代谢率Fig.6 The energy metabolic rate of echiuran worm exposed to various pH values

2.3 氨氮含量的变化对单环刺螠代谢的影响

由图7 可知：随着氨氮浓度的升高，单环刺螠的耗氧量和耗氧率先下降后趋平稳（图7）。氨氮为0.0699 mg/L 时，耗氧量和耗氧率最高，分别为0.6700 mg/h 和0.1100 mg/g·h。氨氮为0.0736～1.0200 mg/L时，耗氧率之间无显著差异（P＞0.05）。对单环刺螠氨氮浓度和耗氧率的回归关系呈幂函数：Y=0.1101X-0.487（R2=0.7153，X 为氨氮浓度，Y 为耗氧率）。

图7 氨氮对单环刺螠耗氧量和耗氧率的影响Fig.7 Effects of ammonia nitrogen on oxygen consumption and oxygen consumption rate of echiuran worm

氨氮对单环刺螠排氨量和排氨率的影响见图8。在氨氮为0.0699～1.0200 mg/L 时，各组单环刺螠的排氨率没有显著差异（P＞0.05）。

图8 氨氮对单环刺螠排氨量和排氨率的影响Fig.8 Effects of ammonia nitrogen on amount and rate of ammonia excretion of echiuran worm

氨氮对单环刺螠呼吸代谢的氧氮比和能量代谢率的影响见图9 和图10。由图9 和图10 可知：随着氨氮浓度升高，氧氮比波动式变化，最后下降，当氨氮为0.0699 mg/L 时，氧氮比最高28.66。随着氨氮浓度升高，单环刺螠的能量代谢率先下降，后平稳。氨氮为0.0699 mg/L 时，能量代谢率最大1.48 J/g·h（P＜0.05）。

图9 不同氨氮浓度下单环刺螠的氧氮比Fig.9 The oxygen nitrogen ratio of echiuran worm exposed to different ammonia nitrogen concentrations

图10 不同氨氮浓度下单环刺螠的能量代谢率Fig.10 The energy metabolic rate of echiuran worm exposed to different ammonia nitrogen concentrations

2.4 亚硝酸盐含量的变化对单环刺螠代谢的影响

亚硝酸盐含量对单环刺螠耗氧量和耗氧率的影响见图11。由图11 可知，随着亚硝酸盐浓度的增加，单环刺螠的耗氧量和耗氧率先升高后下降。当亚硝酸盐浓度为0.0502 mg/L 时，耗氧量和耗氧率达最大峰值；当亚硝酸盐浓度为0.4960 mg/L 时，耗氧量和耗氧率值最低，最低和最高的耗氧率差异显著（P＜0.05）。亚硝酸盐浓度与单环刺螠耗氧率呈二次多项式关系：Y=-0.0066X2+0.0357X+0.0361（R2=0.9289，X 为亚硝酸盐浓度，Y 为耗氧率）。

图11 亚硝酸盐浓度对单环刺螠耗氧量和耗氧率的影响Fig.11 Effects of nitrite concentration on amount and rate of oxygen consumption in echiuran worm

亚硝酸盐含量对单环刺螠的排氨量和排氨率的影响见图12。由图12 可知，亚硝酸盐浓度为0.0256 mg/L 和0.0738 mg/L 时，单环刺螠的排氨量和排氨率高于其他三组，各组间差异不显著（P＞0.05）。亚硝酸盐浓度为0.4960 mg/L 时，排氨量和排氨率最低。

图12 亚硝酸盐对单环刺螠排氨量和排氨率的影响Fig.12 Effects of nitrite concentration on amount and rate of ammonia excretion in echiuran worm

亚硝酸盐对单环刺螠呼吸氧氮比和能量代谢率的影响见图13 和图14。由图13 和图14 可知：随着亚硝酸盐浓度的升高，氧氮比先升高后下降，当亚硝酸盐浓度为0.0502 mg/L 时，氧氮比最高，且与硝酸盐为0.0256 mg/L 时差异显著（P＜0.05）。随着亚硝酸盐浓度的增加，单环刺螠的能量代谢率先升高后下降。亚硝酸盐浓度为0.0502 mg/L 时，能量代谢率最高，与亚硝酸盐为0.4960 mg/L 时差异显著（P＜0.05）。

图13 不同亚硝酸盐浓度下单环刺螠的氧氮比Fig.13 The oxygen nitrogen ratio of echiuran worm exposed to different nitrite concentrations

图14 不同亚硝酸盐浓度下单环刺螠的能量代谢率Fig.14 The energy metabolic rate of echiuran worm exposed to different nitrite concentrations

3 讨论

3.1 溶解氧浓度对单环刺螠代谢的影响

耗氧率和排氨率为生物体呼吸代谢水平的重要指标。本实验中单环刺螠耗氧量和耗氧率随时间的延长逐渐降低，前2 h 呼吸瓶中溶氧充足，耗氧量和耗氧率高于其他各组。2 h 后随着单环刺螠的呼吸代谢耗氧，呼吸瓶中溶氧量降低，单环刺螠呼吸略受限，耗氧量和耗氧率滑坡式下降，表明其呼吸代谢机能减弱。4 h 以后单环刺螠的呼吸代谢进一步受到氧浓度降低的限制，耗氧量和耗氧率达到最低值，且第4 h 和第5 h 的耗氧量和耗氧率无显著变化（P＞0.05），说明4 h 后单环刺螠呼吸代谢受到显著影响。

能量代谢率反映生物代谢能力，适宜条件下新陈代谢旺盛，活动能力强，生长快速。本实验也反映了在溶氧充足的条件下，单环刺螠活动能力强，能量消耗率高，溶氧受限时抑制了呼吸代谢，活动能力下降。因此在工厂化养殖中，为不影响单环刺螠生长代谢需保持溶解氧充足，以利于单环刺螠生长。

3.2 pH 对单环刺螠代谢的影响

3.2.1 pH 对单环刺螠耗氧率和排氨率的影响

pH 是水生动物环境中重要的理化指标之一，pH 变化会直接影响水生动物的生理代谢，因此，pH是工厂化养殖所关注的重要水环境指标。本实验中，随着pH 的升高，单环刺螠的耗氧量和耗氧率呈先升高后下降的趋势。pH 为8 时，耗氧量和耗氧率达到峰值；pH 为10 时，耗氧量和耗氧率较pH 为8显著下降。推测这有两种可能：其一，pH 升至8 时为单环刺螠适宜生存条件，代谢增强，pH 升至10时，单环刺螠不适应，代谢下降；其二，pH 的升高单环刺螠耗氧量和耗氧率升高是为了获得更多的能量，补偿性提高呼吸代谢，对抗环境pH 升高对自身的伤害。研究发现，弱碱性环境下水生生物呼吸代谢能力增强。唐保军等[13]研究发现，pH 为8 时，细角螺Hemifusus termatamus 的耗氧率最高，pH 升高或降低，细角螺耗氧率均显著降低。pH 为7.1 和8.9时，田螺Viviparus.contectoides 出现耗氧率峰值，而pH 升高或降低，其耗氧率均下降[14]。日本沼虾Macrobrachium nipponensis[15]等水生生物也有类似结果。许星鸿等[16]采用正交实验法研究了不同盐度、pH 及温度对单环刺螠肠消化酶活力的影响，发现盐度25～35、pH6～9 为单环刺螠较适宜的环境条件，与本实验结果一致。孙涛等[11]研究pH 对单环刺螠呼吸排泄的影响时得出，pH5～9 条件下，pH 值变化显著影响单环刺螠的耗氧率和排氨率。单环刺螠的耗氧率随pH 升高呈先上升后下降的趋势，pH 为8 时出现最大值，此时单环刺螠呼吸代谢最旺盛。本实验中，pH 在6～10 条件下，单环刺螠的耗氧率随pH 升高呈先上升后下降的趋势，pH8 时为最大值，说明单环刺螠在弱碱性环境中代谢旺盛。

本实验中，单环刺螠的排氨量和排氨率随pH的升高先升高后降低，pH 为7 时达峰值。pH 超过7以后，排氨率显著下降，8～10 之间差异不显著（P＞0.05）。排氨量和排氨率变化趋势与耗氧量和排氨率接近，表明pH 为7～8 时为单环刺螠呼吸和代谢的适宜条件。

3.2.2 pH 对单环刺螠氧氮比和能量代谢率的影响

氧氮比（O/N）表示生物体内蛋白质、脂肪和碳水化合物分解代谢之间的关系。O/N 大表明动物消耗的能量主要由脂肪和糖提供。Mayza-lld[17]提出：O/N 约为7 时，生物体能量完全由蛋白质氧化提供；Ikeda[18]认为，O/N 约为24 时，生物体所需能量由蛋白质和脂肪氧化提供。当能量物质主要为脂肪或碳水化合物时，O/N 将变为无穷大[19]。本实验中，随着pH 的升高，氧氮比先升高后缓慢降低，pH8 时最大，pH9 时略有降低但不显著（P＞0.05）。pH7 以后氧氮比均大于7，pH8 时氧氮比最大为10.48，说明在pH 小于8 时，单环刺螠主要消耗蛋白质提供能量。pH8 及以后，代谢能源物质由蛋白质转为蛋白质和脂肪。

当pH 为8 时能量代谢率达到峰值，pH 为7、9、10 时，三组的能量代谢率差异不显著（P＞0.05），说明pH 为8 左右时，单环刺螠生活条件适宜。

3.3 氨氮对单环刺螠代谢的影响

3.3.1 氨氮对单环刺螠耗氧率和排氨率的影响

游离氨NH3不带电荷，易通过细胞膜，毒性比铵盐大几十倍[20]。氨氮影响单环刺螠、日本沼虾和河蚌Anodonta woodiana 耗氧率[21]。本实验中，单环刺螠稚螠随氨氮浓度增加耗氧量和耗氧率的变化呈先下降，后相对平稳，又下降的趋势。氨氮为0.0699 mg/L 时，耗氧量和耗氧率值最高；氨氮为1.0200 mg/L 时，耗氧量和耗氧率值最低。说明单环刺螠有一定的适应氨氮浓度变化的能力，以至于当氨氮为0.0736～0.6150 mg/L 时，可以维持耗氧量和耗氧率的相对平稳。随着氨氮浓度继续升高，耗氧量和耗氧率值再次下降。但氨氮在0.0736～1.0200 mg/L 范围时，各组耗氧率差异不显著（P＞0.05），这可能是其对海底环境长期适应的结果。海洋底层溶解氧量较低，浮游植物分布少，氨氮难以吸收，底层氨氮含量普遍高于表层[22]，单环刺螠经过长期的进化与环境相适应，具备相应生态位生物的生理结构功能，适应其特殊的生长环境。

本实验设定的氨氮梯度下，各组单环刺螠的排氨率没有显著差异（P＞0.05），说明氨氮0.0699～1.0200 mg/L 对单环刺螠排氨率影响较小。

3.3.2 氨氮浓度对单环刺螠氧氮比和能量代谢率的影响

Widdows[23]认为，尽管尚未证明O/N 差异值对机体的生长速率和个体生长状况有直接影响，但很多迹象表明，O/N 的变化与机体所受的压力有密切的联系，O/N 可以作为生物对环境适应程度的一项指标。本实验数据表明，当氨氮浓度为1.0200 mg/L时，O/N 超过24.0，能量物质由脂肪和碳水化合物组成；度继续升高后O/N 下降，但均大于7.0，能量代谢物由脂肪和碳水化合物转变成蛋白质和脂肪，脂肪占比增大、代谢产能量升高，维持正常的生理代谢，这可能是单环刺螠感受到环境中氨氮毒性压力，改变代谢来加大能量消耗，抵御环境中氨氮的毒性对身体的伤害。

3.4 亚硝酸盐含量对单环刺螠代谢的影响

随着集约化水产养殖模式的发展，残饵、养殖动物代谢废物长期积累，导致养殖水环境和底泥环境不断恶化。亚硝酸盐含量超标是集约化养殖容易出现的问题。亚硝酸盐长期超标会使动物血液载氧能力下降，轻者影响生长，重则导致养殖动物中毒死亡，因此必须重视[24]。本实验中，单环刺螠的耗氧量和耗氧率随亚硝酸盐浓度的增加先升高后下降。前四组的耗氧率无显著差异（P＞0.05），而最后一组的耗氧率又与前两组没有显著差异（P＞0.05）。这说明单环刺螠对水环境中亚硝酸盐浓度耐受范围较宽。

在本实验设定的亚硝酸盐浓度下，O/N 大于24，且各组的氧氮比无显著差异（P＞0.05），表明代谢供能主要是消耗脂肪和碳水化合物，适应不同亚硝酸盐浓度的变化，以维持机体正常代谢。