小鼠原代哺乳期乳腺细胞中TSH对钠碘同向转运体的调节作用

史新竹，申红梅

（1.沈阳医学院公共卫生学院流行病学教研室，辽宁沈阳110034；2.哈尔滨医科大学中国疾病预防控制中心地方病控制中心）

哺乳期妇女适宜的碘营养，是下一代在胎儿期和出生后早期脑发育的重要保障。哺乳期妇女碘营养不足，势必会给下一代带来因碘缺乏所致的各种危害。钠碘同向转运体（sodium iodide symporter，NIS）是甲状腺摄取碘的生理基础，介导碘转运至甲状腺滤泡细胞内合成甲状腺激素。NIS也是哺乳期乳腺重要的摄碘蛋白，但仅存在于妊娠期和哺乳期的乳腺中［1］。甲状腺NIS活性受到促甲状腺激素（TSH）、碘、雌激素等的影响。TSH主要调控甲状腺的功能和碘的摄取，是影响NIS表达和定位的主要因素，对NIS基因的表达起到促进作用［2］。目前公认的甲状腺NIS调控信号通路是环磷酸腺苷（cAMP）/蛋白激酶A（PKA），主要受到TSH调节，属于正向调节通路［3］。在一定程度上TSH的磷酸化模式依赖于PKA调节完成［4］。乳腺是对激素非常敏感的器官，内分泌功能改变和腺体疾病均能对其产生直接影响。本课题组前期观察不同碘水平下哺乳期乳腺摄碘调节因素时发现，哺乳期乳腺NIS水平的调节因素与甲状腺相似［5］。为探讨TSH对哺乳期乳腺NIS表达中发挥的作用，本研究在原代哺乳期乳腺细胞中观察了TSH对NIS表达的调节作用。

1 资料与方法

1.1 主要试剂 TSH（美国Sigma公司），实时荧光定量PCR试剂盒（大连宝生物工程有限公司），PKA抑制剂（H-89）（美国Cayman Chemical公司），促甲状腺激素受体（TSHR）抗体、NIS抗体（美国ABBIOTEC公司）、β-actin单克隆抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.2 仪器与设备 实时荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad公司），Odyssey红外线成像系统（美国LI-COR公司），倒置相差显微镜（日本Olympus公司），凝胶电泳仪（美国Pharmacia Biotech公司），酶标仪（上海天呈科技有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 培养原代哺乳期乳腺细胞 BALB/c小鼠（北京维通利华实验动物技术有限公司）喂饲普通饲料（北京科澳协力饲料有限公司)，饮用蒸馏水。当雌性小鼠体重达到20 g时，挑选皮毛光滑无病雌性小鼠与成熟雄性小鼠按5∶1比例合笼交配。受孕后分笼观察其生产情况。

提取哺乳期BALB/c小鼠乳腺组织于DMEM/F12培养基中洗涤，制备组织匀浆。胶原酶消化后，置于37℃震荡孵育箱内消化15～20 min，120 r/min。研磨过滤未消化完全的组织，加DMEM/F12培养基于滤液中终止消化，制成细胞悬液。调整细胞密度，置于培养瓶中，5%CO2、37℃培养箱中，培养72 h。待细胞贴壁生长并铺满瓶底90%后传代。

1.3.2 实验分组 第二代细胞分组干预。将TSH用去离子水稀释配制成不同剂量。TSH不同剂量组：分别用不同剂量 TSH（0、0.01、0.03、0.05 μg/ml）干预细胞 24 h；沉默分组：50 nmol/L TSHR siRNA组、阴性对照组和平行空白组；PKA抑制组：H-89抑制PKA 30 min后加入0.03 μg/ml TSH干预24 h，同步设置0.03 μg/ml TSH干预组和空白组。

1.3.3 实时荧光定量PCR法检测原代哺乳期乳腺细胞NIS mRNA的表达 无血清DMEM/F12培养基培养细胞24 h，PBS洗涤6孔板中细胞3次，预冷Trizol裂解细胞3 min；三氯甲烷分离裂解细胞，移液器吸取中间清亮水相部分，加入与吸取液体等量异丙醇，混匀，室温静置10 min，4℃ 12 000 r/min离心10 min，留取沉淀；预冷75%乙醇洗涤RNA并测定RNA浓度；配制逆转录反应体系，在PCR梯度仪合成cDNA，实时荧光定量PCR仪实现扩增反应。

反应条件为95℃预变性30 s；95℃变性5 s；60℃（NIS）／58℃（β-actin）退火20 s，72℃延伸20 s，共40个循环；72℃终延伸10 min。引物见表1。

表1 PCR引物序列

1.3.4 Western blot法检测NIS蛋白的表达 细胞加入裂解液10 min，充分刮取蛋白，12 000 r/min离心20 min，收集上清蛋白，测蛋白浓度。电泳2 h，PVDF转膜50 min，封闭液封闭1 h。分别用兔抗鼠NIS单抗（1∶400）和单抗β-actin（1∶1 000），4℃过夜。DAB显色，GIS凝胶图像处理系统照相观察。Gelpro软件比较目的条带相对灰度值。

1.3.5 TSHR基因沉默 使用优化培养基培养细胞24 h，lipo2000用无血清的优化培养基稀释，孵育5 min后与siRNA混和，室温孵育20 min，形成siRNA-lipo2000混和物。将siRNA-lipo2000混合液加入细胞，混和。置于5%CO2、37℃培养箱，5 h后换成正常优化培养基培养72 h。

1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。多个总体均数差异比较采用方差分析，两两比较采用t检验。检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 不同剂量的TSH对原代哺乳期乳腺细胞NIS mRNA和蛋白表达的影响 4组NIS mRNA的表达水平比较差异有统计学意义（F=6.51，P＜0.05），0.05 μg/ml TSH组的NIS mRNA表达量最高。4组NIS蛋白表达水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2、图1。

表2 不同剂量TSH组NIS mRNA的表达水平比较（±s）

表2 不同剂量TSH组NIS mRNA的表达水平比较（±s）

注：与0.05 μg/ml TSH组比较，1）P＜0.05

F P TSH（μg/ml）0.05 0.03 0.01 0 n5 5 5 5 NIS mRNA 2.09±0.89 1.22±0.261）0.86±0.271）0.96±0.061）6.510.00

图1 TSH不同剂量组NIS蛋白表达

2.2 TSHR siRNA沉默TSHR基因对NIS蛋白表达的影响 TSHR siRNA组、阴性对照组和空白组的NIS蛋白表达比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2。

图2 沉默TSHR基因后NIS蛋白的表达

2.3 抑制PKA对哺乳期乳腺细胞NIS蛋白表达的影响 PKA抑制组、TSH组和空白组的NIS蛋白表达水平比较差异有统计学意义（F=8.45，P＜0.01），PKA抑制组NIS蛋白表达水平明显低于TSH组和空白组（P＜0.05）。见表3和图3。

表3 抑制PKA后NIS蛋白表达（±s）

表3 抑制PKA后NIS蛋白表达（±s）

注：与PKA抑制组比较，1）P＜0.05

组别PKA抑制组TSH组空白组n3 3 3 NIS蛋白0.29±0.05 0.41±0.021）0.39±0.011）F P 8.450.01

图3 抑制PKA后NIS蛋白的表达

3 讨论

NIS主要位于甲状腺细胞基底外侧膜上，介导碘的主动转运，生产足够的甲状腺激素。有研究证实NIS在多个组织中表达，但仅在甲状腺和哺乳期乳腺中处于高表达状态［6］，这与哺乳期乳腺需碘量增大密切相关。

乳腺哺乳期摄碘量大幅增加，NIS在哺乳期乳腺细胞基底外侧膜表达，从血液中吸取碘化物到乳汁中，高效积累碘化物。甲状腺摄碘受到TSH严格调控，刺激NIS半衰期延长。本研究应用不同剂量TSH作用于哺乳期乳腺细胞，观察到高浓度TSH对哺乳期乳腺细胞NIS的表达有一定调节作用，低浓度TSH作用不明显。本研究还对与TSH结果的关键蛋白TSHR进行沉默，但未观察到细胞NIS水平的显著变化。TSHR属于G蛋白偶联受体，一旦与配体TSH结合，即起到连接细胞内外环境，向细胞内部传递TSH所携带信息的作用。有研究显示在哺乳期乳腺细胞中存在TSHR表达［7］，提示乳腺中NIS很可能受到TSH影响。此次TSHR沉默后未观察到NIS水平变化，其原因可能是沉默过程中产生了RNA干扰的脱靶现象［8］，当siRNA与靶位点序列完全互补配对时，复合体直接切割靶标mRNA，导致其被快速降解，其他可能原因需进一步探讨。

本研究抑制PKA活性后，抑制组NIS蛋白表达量显著低于正常对照组，提示PKA作为重要的蛋白激酶在哺乳期乳腺细胞NIS调节过程中，起到上调NIS表达的作用。PKA是一种普遍存在于动物体内的蛋白激酶，且蛋白酶抑制剂可与PKA催化亚基结合抑制PKA活性。甲状腺中TSH主要通过cAMP/PKA信号通路调控细胞增殖、分化及NIS表达，PKA刺激NUE（NIS上游增强子），改变NIS表达［1］。

综上所述，高浓度TSH对小鼠哺乳期乳腺细胞NIS表达具有一定调节作用；蛋白激酶PKA可上调NIS表达。