氯氰菊酯暴露对未成年小鼠大脑皮质及血清5-HT、DA和NE的影响

周礼华，刘函冰，陈韩磊

（蚌埠医学院公共卫生学院，安徽 蚌埠 233000）

拟除虫菊酯（pyrethroid）是人工合成的新型 农药，因其具有高效性、低毒性及低环境持久性等特点广泛应用于农业害虫防治、家庭及公共场所中的卫生害虫防治等方面。目前，拟除虫菊酯类杀虫剂的应用已超过全世界杀虫剂的30%［1］。随着使用量增加，毒性作用逐渐被重视。研究显示，拟除虫菊酯可造成哺乳类动物免疫系统、生殖系统、神经系统等多系统损害［2-4］，其中神经系统的毒性备受关注。脑发育过程中接触农药可能是神经退行性疾病发病的重要危险因素，未成年期暴露会使动物成年后再暴露时易感性增加，而拟除虫菊酯暴露是帕金森病变的危险因素［5-7］。神经递质是神经元间、神经元与靶细胞间发挥信号传递功能的化学物质。单胺类神经递质包括5-羟色胺（serotonin，5-HT）、多巴胺（dopamine，DA）、去甲肾上腺素（noradrenaline，NE）等，单胺类神经递质含量的异常影响着神经系统的正常功能，进而干扰机体运动、睡眠、情感等活动［8］。本研究选用Ⅱ型拟除虫菊酯类杀虫剂——氯氰菊酯（cypermethrin，CYP）作为代表，研究CYP对C57BL/6未成年小年鼠大脑皮质及血清中单胺类神经递质的影响，探讨CYP对神经系统的毒性机制，为规范拟除虫菊酯类杀虫剂合理应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 C57BL/6未成年小鼠18只，4周龄，性别不限，体重（12.39±1.28）g，由蚌埠医学院实验动物中心提供（许可证号：SCXK（苏）2017-0001），饲养条件：温度（24±2）℃，湿度40%～70%。

1.2 药品与试剂 CYP标准品（美国Sigma公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（江苏碧云天生物有限公司）；血清及大脑皮质5-HT、DA、NE酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 实验分组与染毒方法 将未成年小鼠随机为：对照组、CYP 50 mg/kg及CYP 100 mg/kg暴露组，每组6只。实验前各组小鼠体重差异无统计学意义（P＞0.05）。暴露组分别给予CYP 50 mg/kg及100 mg/kg腹腔注射（CYP用玉米油溶解），每日1次，连续4 d。对照组给予等体积生理盐水代替。每日注射前称取小鼠体重，同时，观察实验小鼠日常活动、情绪、摄食、饮水的变化。

1.3.2 小鼠血清制备及5-HT、DA、NE含量测定 小鼠经水合氯醛（0.01 ml/g）腹腔注射麻醉后，摘除眼球取血，每只小鼠收集血液0.4 ml，EP管内室温静置2 h，然后2 000×g离心15 min，血清分离后置于-80℃冰箱储存。严格按照ELISA试剂盒说明书步骤测定血清中5-HT、DA、NE的含量。

1.3.3 小鼠脑组织脏器系数分析 小鼠摘眼球取血后，立即将其断头处死，用剪刀依次剪开皮肤及颅骨，小心取出脑组织，准确称量脑组织重量（以上操作在冰上进行），计算公式：小鼠脏器系数=脑组织重量（g）/小鼠体重（g）×100。

1.3.4 小鼠大脑皮质制备及5-HT、DA、NE含量测定 脑组织称重后，仔细分离小鼠大脑皮质，然后用0.9%生理盐水冲洗，滤纸吸干、称重、剪碎，加入预冷生理盐水（1∶9）制成10%的组织匀浆。将匀浆液5 000×g离心10 min后取上清。严格按照ELISA试剂盒说明书步骤测定大脑皮质单胺类神经递质5-HT、DA、NE含量。样品蛋白浓度测定采用BCA法。

1.4 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差表示，组间比较采用方差分析及LSD检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠一般情况观察及脑的脏器系数测定 实验期间，对照组小鼠活动如常；暴露组小鼠精神萎靡，体毛蓬乱，眼角周围有不同程度分泌物残留。CYP暴露组小鼠脑脏器系数高于对照组，其中CYP 100 mg/kg暴露组脏器系数与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 CYP暴露对未成年小鼠脏器系数的影响

2.2 CYP对小鼠大脑皮质5-HT、DA及NE的影响 CYP 50 mg/kg及100 mg/kg暴露组小鼠大脑皮质5-HT、DA含量均低于对照组（P＜0.05），CYP 100 mg/kg暴露组DA含量低于CYP 50 mg/kg暴露组（P＜0.05）；CYP暴露组与对照组NE含量比较差异无统计学意义。见表2。

表2 未成年小鼠大脑皮质5-HT、DA、NE含量比较

2.3 CYP对小鼠血清5-HT、DA及NE的影响 CYP 50 mg/kg及100 mg/kg暴露组小鼠血清5-HT、DA含量均低于对照组（P＜0.05），CYP 100 mg/kg暴露组5-HT、DA含量低于CYP 50 mg/kg暴露组（P＜0.05）；CYP暴露组与对照组NE含量比较差异无统计学意义。见表3。

表3 未成年小鼠血清5-HT、DA、NE含量比较

3 讨论

拟除虫菊酯是脂溶性化合物，能够穿过血脑屏障到达中枢神经系统，动物未成年期大脑处于高度活跃的神经发育阶段，未成年期暴露易导致潜在的神经毒性，且使动物成年后再暴露时易感性增加［8-9］。拟除虫菊酯从血液和神经组织中消除缓慢，反复暴露会导致毒物在体内蓄积，增加神经退行性疾病的易感性［10］。

单胺类神经递质包括5-HT、DA、NE等，单胺类神经递质含量的异常影响着神经系统的正常功能。Karen等［11］研究发现，拟除虫菊酯能降低C57BL/6成年小鼠纹状体突触小体对DA的摄取，影响小鼠的运动及摄食。DA广泛分布于中枢神经系统，大脑中DA含量与肌肉协调能力密切相关，当脑组织DA含量降低时，动物运动能力下降［12］。DA合成速度主要取决于体内的酪氨酸羟化酶，拟除虫菊酯可通过抑制体内酪氨酸羟化酶的活力，催化合成DA含量减少［13］。NE在DA作用的基础上引发机体进行一系列动作，NE参与维持中枢神经递质之间的动态平衡。5-HT又名血清素，是一种神经递质和内源性活性物质，广泛分布于中枢神经系统和周围组织。拟除虫菊酯类代谢产物残留会造成脑组织各部位5-HT含量下降，且降低程度与拟除虫菊酯的使用量及使用频率有关［14］。拟除虫菊酯引起Na+通道关闭延迟，神经元去极化，神经元过度兴奋，进而干扰神经递质5-HT的正常传递［15］。

本研究以CYP 50 mg/kg、100 mg/kg对C57BL/6未成年小鼠进行腹腔注射，观察小鼠脑脏器系数、大脑皮质及血清中单胺类神经递质5-HT、DA、NE的变化。结果发现，暴露组（CYP 100 mg/kg）小鼠脑的脏器系数高于对照组，差异有统计学意义。暴露组小鼠大脑皮质及血清中5-HT、DA含量低于对照组，且CYP 100 mg/kg暴露组小鼠大脑皮质及血清中DA含量和血清中5-HT含量低于CYP 50 mg/kg组，差异均有统计学意义。由于神经递质测定方法灵敏度较高，特别是单胺类神经递质含量的个体差异较大，本次实验NE在脑皮质和血清中没有达到较为一致的变化趋势，这与柴晓静等［16］的研究不完全一致，可能与暴露方式、暴露时间、暴露剂量以及实验动物的样本量有关。

综上所述，CYP暴露影响C57BL/6未成年小鼠脑脏器系数，降低小鼠大脑皮质及血清中单胺类神经递质5-HT、DA的含量，单胺类神经递质的变化可能是CYP导致神经系统毒性的物质基础，神经损伤的具体途径及相关机制是本实验下一步的研究方向。