天然除虫菊酯化学成分制备分离及光稳定性研究

邓英立，丁 燕,2，Nigel G J Richards，王寅鹏，肖 伟，朱靖博,2*

(1.大连工业大学 食品学院,大连 116034；2.大连工业大学 植物资源化学与应用研究所,大连 116034；3.英国卡迪夫大学 化学院，卡迪夫 CF103AT；4.江苏康缘股份药业有限公司,连云港 222001)

天然除虫菊酯是从除虫菊(Chrysanthemum cinerariifolium)中提取出来的6种单萜酯类物质的统称，包括除虫菊酯I (pyrethrin I)、瓜叶菊酯I (cinerin I)、茉酮菊酯I (jasmolin I)、除虫菊酯 II (pyrethrin II)、瓜叶菊酯II (cinerin II)、茉酮菊酯II (jasmolin II) 6种有效成分[1-3](结构通式如图 1)。它具有低毒、低残留、高效和不易产生抗药性等特性[1,4]，其中除虫菊酯I和II含量高且具有快速击倒和致死害虫效果，是除虫菊农药制剂中的主要有效成分[5]。FAO和WHO对原药的质量标准纯度要求在90%以上[6]，但天然除虫菊酯中各成分结构相似、分子量相近使其分离制备困难[7]。

目前的分离方法都存在进样少、溶剂损失大、只能实现毫克级制备的缺点[8-10]，如 D Wei[10]采用高效液相色谱制备出高纯度化合物，但仅从1 mL 70%除虫菊精油中得到单一成分1 mg；方忠莹[11]借助高速逆流色谱制备得到除虫菊素I (12 mg)和II (24 mg)、瓜叶菊素I (11 mg)和II (17 mg)、茉酮菊素I (9 mg)和II (13 mg)，纯度90%以上。真空液相色谱具有装置简单、进样量大、分离速度快的优点，目前已广泛用于萜类、木脂素和萜类等天然活性物质的分离[12]，如朱靖博等采用 AUTO-VLC(石油醚：乙酸乙酯)富集了木脂素类组分且得到2个纯度＞90%的化合物[13]；Pelletier[14]经 VLC分离纯化得到了乌头中二萜生物碱。除虫菊酯属于单萜酯类化合物，文章首次采用AUTO-VLC分离天然除虫菊酯。

除虫菊酯对温度、光照、氧气和 pH等环境因素敏感，暴露于环境中会很快失去活性，其最主要的降解方式是光化学降解[15]，除虫菊酯分子含有三元环、双键和酮基等结构，见光不稳定[16]，其吸收光能后共价键断裂发生降解。Pan研究发现天然除虫菊酯在田间的降解速度快于温室条件下，证明光降解是其降解的重要途径[3]。见光易降解特性使天然除虫菊酯类农药商品化使用和质量控制受到极大的限制[16]。而在农药制剂中添加光保护剂如木质素[17]、BHA[18]和竹醋酸[19]等，可在一定程度上改善农药光不稳定性。本文重点研究采用AUTO-VLC对天然除虫菊酯目标物制备分离；探讨分离得到的馏分的光稳定特性及光保护剂对其稳定性的影响。研究旨在为天然除虫菊酯农药大规模生产以及研制稳定的除虫菊酯制剂提供理论支持，加速植物源农药的发展进程。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

天然除虫菊酯粗提物(总含量49%)及混合标准品(云南南宝生物科技有限责任公司)；二叔丁基对甲酚、焦性没食子酸、3,4,5-三羟基苯甲酸、2-羟基-4-甲基二苯甲酮、木质素磺酸钠(国药集团化学试剂有限公司)；乙腈、甲醇、正己烷、乙酸乙酯(天津康科德科技有限公司)；高效液相色谱S6000(大连华谱新创新技术有限公司)；分体式照度计、紫外灯(深圳市聚茂源科技发展公司)；PC型紫外分光光度计(大连源博科学器材有限公司)；Bomexc C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 µm)、自动化真空液相色谱、制备型高效液相色谱(大连博迈科技发展有限公司)。

图 1 除虫菊酯提取物中 6 种除虫菊酯的结构[3]错误!未找到引用源。

1.2 色谱方法

1.2.1 HPLC分析方法

采用华谱S6000色谱系统对天然除虫菊酯进行分析，分析柱选择C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 µm)；流动相由0.1%乙酸水溶液(A)和乙腈(B)组成；洗脱梯度为：0～10 min(48%～62% B)、10～40 min(62%～80%B)、40～50 min(80%～100% B)；流速为 1.0 mL/min；进样量是10 μL；柱温为30 °C；检测波长230 nm。

1.2.2 TLC分析方法

选用3 cm×10 cm的薄层硅胶色谱板，用毛细管吸取天然除虫菊酯溶液在薄层板基线中央点样，溶液单向上行展开，展开剂：正己烷∶乙酸乙酯=9∶1(体积比)；显色剂：浓硫酸香草醛；显色后100 ℃烘干，计算斑点Rf值。

1.3 标准对照图谱的建立

精密称取天然除虫菊酯混合标准品和粗提物各5 mg，分别加入乙腈配置成1 mg/mL溶液，经0.45 μm微孔膜过滤，使用高效液相色谱测定混合标准品和除虫菊酯浸膏，分析方法见1.2.1；使用薄层色谱法测定混合标准品(图2-b)，分析方法见1.2.2。

1.4 天然除虫菊酯化学成分制备分离

1.4.1 AUTO-VLC洗脱剂和洗脱条件的筛选

选择洗脱剂1 (正己烷∶乙酸乙酯=95∶5，体积比)、洗脱剂2 (正己烷∶氯仿=95∶5)、洗脱剂3(氯仿∶丙酮=95∶5) 3种洗脱剂对0.6 mg/mL的天然除虫菊酯样品进行展开，按照1.2.2方法，计算Rf值，筛选出最佳洗脱剂。

图2 天然除虫菊酯混合标准品和粗提物HPLC图(a)和TLC图(b)

改变最佳洗脱体系体积比，增加溶剂强度(100∶0、 99∶1、98∶2、97∶3、96∶4、95∶5、94∶6、93∶7、92∶8、91∶9、90∶10……)，使化合物在薄层板上依次展开，按照1.2.2方法，计算Rf值，确定AUTO-VLC制备分离天然除虫菊酯的分离条件。

1.4.2 AUTO-VLC 分离天然除虫菊酯

采用 AUTO-VLC对天然除虫菊酯进行分离研究，选择SiO2填料柱(150 mm×280 mm)；取2 000 g(200～300目)硅胶填充至色谱柱内；取100 g天然除虫菊酯与200 g硅胶干法混合样品；洗脱剂为正己烷和乙酸乙酯；柱压为0.6 MPa，设定10个储液罐抽真空时间分别为20 min，自动收集每份样品，分别浓缩、干燥、称重，进行HPLC分析。

1.5 天然除虫菊酯光稳定性研究

1.5.1 天然除虫菊酯光降解规律研究

1.5.1.1 天然除虫菊酯紫外光照射稳定性试验[20]

配制天然除虫菊酯 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 5个浓度的溶液，用移液管准确移取样品溶液1 mL，均匀地涂在直径为5 cm的玻璃培养皿上，让溶剂蒸发。将培养皿暴露在紫外灯下，对照组覆盖铝箔置于黑暗中。采用照度计测定累计光照强度，设定紫外累计光照强度 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3×104Lux，分别取不同累计光照强度下的样品板，用甲醇(1 mL)提取，HPLC分析。分别根据公式⑵和⑶计算降解率和光解半衰期(T1/2)，每处理重复3次。

1.5.1.2 天然除虫菊酯太阳光照射稳定性试验[20]

太阳光照试验在无云日(9月至10月)上午9时至下午5时进行，使样品能获得最多的直射阳光。培养皿表面温度变化范围为 25～35℃。按照 1.5.1.1方法操作，设置太阳累计光照强度0、5、10、15、20、25×104Lux，分别取不同太阳累计光照强度下的样品板，用甲醇(1 mL)提取，HPLC分析。计算天然除虫菊酯的降解率和半衰期，每处理重复3次。

式中：C0为天然除虫菊酯的初始浓度，C为天然除虫菊酯光强下的未降解浓度，k是光降解速率常数。

1.5.1.3 不同波长紫外光下天然除虫菊酯降解试验

准确称取天然除虫菊酯6 mg，加入乙腈配置成0.6 mg/mL溶液，测定在不同波长(200～400 nm)紫外光下天然除虫菊酯的降解率，每处理重复3次。

1.5.2 稳定剂对天然除虫菊酯稳定效果的研究

将天然除虫菊酯分别与稳定剂(木质素磺酸钠、3,4,5-三羟基苯甲酸、二叔丁基对甲酚、焦性没食子酸、2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮)按 1∶1加入甲醇溶液中，溶解、配置成除虫菊酯-稳定剂0.6 mg/mL的溶液，用移液管取1 mL于培养皿中，蒸发溶剂后将培养皿置于紫外光和太阳光下，待紫外光累计光强达到3×104Lux，太阳光强累计达到 25×104Lux后移取1 mL甲醇于培养皿中提取，进行HPLC分析，测定5种稳定剂保护效果，筛选最佳保护剂。改变除虫菊酯精油与最佳稳定剂溶液的比例(摩尔比)(1∶0.1、1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2)，按上述方法，筛选两者最佳比例，每处理重复3次。

2 结果与讨论

2.1 天然除虫菊酯化学成分的分离

2.1.1 AUTO-VLC 洗脱剂和洗脱条件的选择

AUTO-VLC成功分离主要取决于能否选择合适的两相溶剂系统，通常是通过TLC法来选择[21]。薄层色谱分析结果显示：洗脱剂1处理的薄层板上出现2个深蓝色的斑点，由混合标准对照TLC图(图2-b)及公式⑴可知，靠近前沿的斑点是除虫菊酯 I类化合物，Rf是0.28；另一个斑点是除虫菊酯II类化合物，Rf是0.1，在365 nm及245 nm处有荧光且出现斑点，斑点分布均匀，组分分离效果较好。洗脱剂 2处理出现拖尾现象，Rf接近于 0，组分在原点未展开，增大极性，组分出现一定分离度，仍存在拖尾现象，这说明此洗脱体系不适合。洗脱剂 3中所有组分在靠近溶剂前端的位置紧密洗脱在一起，即组分不被固定相吸附。经观察比较，最终选择洗脱溶剂1 (正己烷和乙酸乙酯)进行分离。

改变正己烷和乙酸乙酯体积比，增加溶剂强度，使化合物在薄层板上依次展开[22]，得到适合天然除虫菊酯的洗脱比例。试验结果表明(表1)：随着乙酸乙酯含量的增加，Rf增大；一般认为绝对Rf为0.2，相对Rf为 0.1[23]时，洗脱强度适合于色谱柱分离，当正己烷∶乙酸乙酯=96∶4 (体积比)时，Rf(Py I)=0.201，洗脱体积5 BV，Rf(Py II)=0.077，洗脱体积13 BV。综合考虑洗脱体积以及除虫菊酯分离效果，选择正己烷∶乙酸乙酯=96∶4，洗脱体积13 BV作为AUTO-VLC分离天然除虫菊酯的条件。

2.1.2 AUTO-VLC分离天然除虫菊酯

在优化的AUTO-VLC分离条件下，100 g样品经过AUTO-VLC分离共得到49个组分(V1～V49)，耗时仅为16.5 h。根据TLC分析结果合并相似组分共得到10个组分，依次命名为A～J。通过与标准对照图谱(图2-a)比对发现天然除虫菊酯目标化合物与杂质得到明显的分离，表2显示组分C、D、E、G、H、I和J目标化合物纯度在90%以上，总质量52.1 g，其中组分E的除虫菊酯I纯度达到93.5%，组分H中除虫菊酯II纯度达到92.3%，组分I中除虫菊酯II纯度达到90.4%，达到FAO和WHO对原药的质量标准纯度在 90%的要求。目标化合物回收率92.5%。试验结果表明：AUTO-VLC相较于传统制备方法取得重大突破，实现克级以上的制备量，对天然除虫菊酯复杂组分有很好的分离效果，且分离时间短，耗费溶剂少，回收率高。

表1 AUTO-VLC分离条件的确定

表2 AUTO-VLC分离天然除虫菊酯组分信息

2.2 天然除虫菊酯光稳定性研究

2.2.1 天然除虫菊酯光降解规律研究

紫外光和太阳光波长范围不同，提供的能量不同[24]，对不同初始浓度的样品进行不同累计光强的紫外光和太阳光照射。结果表明(图3)：光照初期降解速率较高而后降解趋于平缓，天然除虫菊酯初始浓度越高，全部降解所需光强越多，早期降解量越多；0.2 mg/mL除虫菊酯在紫外光累计光强达到2.5×104Lux时完全降解，而在太阳光累计光强达到20×104Lux时完全降解，这说明紫外光对天然除虫菊酯的降解作用明显高于太阳光。进一步研究了天然除虫菊酯在不同波长紫外光下降解规律(表 3)，结果表明：在紫外波长为230 nm时天然除虫菊酯降解最快，且波长为200～290 nm时降解速率较快，波长在350 nm以上时降解缓慢。天然除虫菊酯主要在波长较短的紫外光下降解。紫外光波长短，能量高，穿透性强，天然除虫菊酯降解快[23]。

天然除虫菊酯的浓度随累计光强的变化用一级动力学方程ln(C0/C)=kt拟合如图4，拟合方程动力学参数列于表3，通过图4和表3可知在紫外光下二者的线性相关系数R2：0.968～0.985，太阳光下线性相关系数R2：0.839～0.926。这表明天然除虫菊酯的光解符合准一级动力学方程。随着天然除虫菊酯初始浓度增加，其降解速率增加，半衰期减小。

图3 天然除虫菊酯浓度随紫外累计光照强度(a)和太阳累计光照强度(c)变化曲线

表3 天然除虫菊酯溶液在不同波长紫外光下的降解率

2.2.2 光稳定剂对天然除虫菊酯稳定效果研究

光稳定剂能选择性地吸收高能量的光，使之变成无害的能量释放或消耗，从而对农药起到保护作用[25]。不同稳定剂对天然除虫菊酯在不同光照下保护作用如图5-1，由图5可知5种保护剂的保护效果依次是 2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮＞木质素磺酸钠＞焦性没食子酸＞3,4,5-三羟基苯甲酸＞二叔丁基对甲酚。

在紫外光累计光强3×104Lux和太阳光累计光强25×104Lux时，在2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮的保护下除虫菊酯降解率分别是9.8%、17.9%，这种稳定剂强烈的保护作用可能与它结构有关，它能被紫外线激活，变成鲲型结构并随之放出荧光而被还原[11,16]。该过程能大量吸收紫外线，从而可以屏蔽紫外光对天然除虫菊酯的降解[25]。

图4 不同浓度天然除虫菊酯光降解反应ln(C0/C)与累计光照强度的关系图

表4 不同浓度的天然除虫菊酯光降解反应动力学参数

不同用量的2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮保护天然除虫菊酯免于光降解的情况如图 5-2。由图 5-2可知，当天然除虫菊酯与2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮比例为1∶0.5时，天然除虫菊酯在紫外光下降解率降低了 76.1%，在太阳光下降解率降低了 65.1%，可见2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮的保护作用明显；当两者比例为 1∶1时，天然除虫菊酯在紫外光下降解率为 10.1%，太阳光下降解率为 15.9%；在一定范围内，随着两者比例增加，天然除虫菊酯降解率下降，2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮对天然除虫菊酯保护效果增强，当两者比例达到1∶1后降解率下降不明显。综上可知，天然除虫菊酯与 2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮的摩尔比为1∶1时，2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮可显著降低天然除虫菊酯的光降解性，这为研制稳定高效的除虫菊酯农药制剂提供了理论支持。

3 结 论

随着天然产物的分离朝着全自动、全成分和较大制备量的方向发展，许多中药成分采用自动化的制备色谱进行研究。本文是首次采用AUTO-VLC对天然除虫菊酯化合物制备分离进行探究，分离过程中建立了TLC展开筛选AUTO-VLC分离条件的方法，即洗脱剂为正己烷∶乙酸乙酯=96∶4(体积比)，洗脱量为13 BV，从100 g天然除虫菊粗提物中分离得到纯度在90%以上的除虫菊酯I (16.5 g)和除虫菊酯II (13.05 g)，耗时16.5 h。AUTO-VLC较传统制备液相色谱分离所用时间缩短，且打破只能实现毫克制备的局限。此研究为天然除虫菊酯分离提供新的分离技术平台。

紫外光和太阳光照射下天然除虫菊酯的光解均符合一级反应动力学规律，随着天然除虫菊酯初始浓度增加，其降解速率增加，半衰期减小，光照初期除虫菊酯降解速率较高而后趋于平缓。天然除虫菊酯在紫外光下降解率明显大于可见光下，且在波长230 nm下出现最大降解率。研究发现除虫菊酯活性物质的羟基容易降解，酸和醇部分容易发生氧化，在紫外光照射下更容易降解[26]，这与文章中天然除虫菊酯在紫外光下更容易降解的情况相一致。

5种保护剂的保护效果依次是2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮＞木质素磺酸钠＞焦性没食子酸＞3,4,5-三羟基苯甲酸＞二叔丁基对甲酚，且除虫菊酯与2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮保护剂的摩尔比为1∶1时，2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮对天然除虫菊酯保护效果最好。

试验结果可为天然除虫菊酯农药大规模制备分离及制备合适的稳定制剂提供理论依据，促进其商品化进程。但本课题对除虫菊酯类农药制剂及在农田中的应用还需要进一步的研究。