我国创制农药生物测定概述与展望

陈 杰*，袁 静，许勇华

(1.浙江农林大学 浙江省绿色农药2011协同创新中心，杭州311300；2.浙江省化工研究院有限公司，杭州310023)

农业生产中，各种农作物病、虫、草害的频繁发生带来了巨大的损失，严重威胁粮食产量和品质。有害生物化学防治是现代农业生产实践中保证农作物高产、稳产和品质的重要手段。根据世界粮农组织(FAO)评估，通过使用农药进行有效的防治，可挽回全世界农作物总产量30%～40%的损失。诺贝尔奖获得者、小麦育种学家Noman K.Borlang曾经说：“没有农药，人类将面临饥饿的危险”。农药是农业必需投入品，在近百年的历程中，农药新品种不断问世，至今已经有681个有效成分，应用于市场的登记产品有4万多。农药创制是一项高投入、高风险、高回报的长期项目，新农药品种必须同时满足“高效、安全、经济”的要求。据Phillips McDougall公司统计，成功上市1个新农药品种，平均需要筛选16万个化合物，耗资约3亿美元，耗时12年[1]。作为农药研发流程中被誉为“眼睛”和“航标”之称的生物活性测定[简称生物测定(bioassay)]，贯穿于新化合物结构设计优化、活性发现、前期研究、开发登记、生产应用到产品生命周期管理(图1)。随着具有新作用机制的农药新品种的不断问世、新合成方法的产生、外来有害生物的入侵、抗药性有害生物的发生以及新型助剂在农药制剂研发中的应用，生物测定技术水平亟需发展。笔者根据多年的工作经验，概述了我国新农药研发中生物测定的主要内容和现状，并展望其发展趋势。

图1 创制农药研究与开发评估流程及闸门

1 农药生物测定研究内容及作用

农药生物测定(pesticide bioassay)是指运用特定的试验设计，利用生物整体或离体的组织、细胞或酶等靶标对农药的反应，并以生物统计为工具统计分析测试对象在一定条件下的效应，评价某种作用物的生物活性[2]。农药生测现在已发展成为集昆虫学、植物病理学、微生物学、植物学、杂草学、有机化学、分子生物学、信息学和统计学等多学科于一体的综合技术，是农药科技创新工程中不可或缺的关键技术。农药生测技术水平决定着新农药创制研发的进程和质量。新农药的开发必须依赖生物活性测定所获得的各项结果和信息，以此评价其商品化价值。生物测定是以标准化的靶标生物和试验方法，测定作用物的生物活性、安全性、作用特性、作用方式和应用范围，明确药剂特性和市场应用前景。其研究内容：⑴ 创制研究阶段生物测定，包括新化合物生物活性筛选，结构与活性构效关系研究，发现新的作用机制，高活性化合物深入筛选研究和田间小区药效筛选试验等；⑵ 创制开发阶段即产品登记和市场应用阶段生物测定，包括农药组合物复配配方筛选和联合毒力测定研究，候选物的区域性多点多靶标田间应用技术研究，农药登记田间药效试验、示范推广试验和抗性风险及其机理研究等；⑶ 产业化阶段生物测定，包括扩大使用范围，剂型和组合物开发，抗性监测与管理等。

1.1 创制研究阶段生物测定

通过标准的试验方法，以模式化的菌、虫、草为测试靶标，按照规范的筛选流程，对大量的新物质样品(化合物或提取物)进行农药生物活性筛选。主要目的是发现活性，确证活性大小、温室效果和作用特性等，初步确定应用范围和防治对象等，发现新作用方式，提供QSAR数据等。

1.1.1 普筛、初筛和复筛研究

普筛：单一剂量试验，以菌、虫、草模式靶标生物为测试对象，明确新化合物是否具有农药生物活性。

初筛：设置 3～5个剂量(浓度)试验，以普筛有活性的靶标为测试对象，确证样品生物活性，通过活性比较明确构效关系。

复筛：设置5～7个剂量的毒力测定试验，扩大试验靶标范围，明确对敏感作用对象的活性(EC50/90、ED50/90或LC50/90)、防治谱和对作物的安全性，初步评价其潜在的成药性；对于除草活性化合物，需要求出其对安全性高的作物的 ED10[3]，对于杀虫或杀菌活性化合物，需要测定对应用对象的安全性，并与商品化药剂进行比较，以评价是否可进行田间小区药效验证筛选试验。

田间小区验证筛选：复筛后的进筛化合物，在季节适合的条件下尽快开展田间药效试验，在田间自然生态环境条件下，对获得的靶标温室效果和作物安全性结果进行确认，为进一步的研究提供依据。

1.1.2 深入筛选/田间小区验证筛选研究

主要开展目标物的作用谱、作用特性、作物安全性以及田间小区药效试验等研究，明确化合物的作用特点、防治对象、目标市场和使用技术等，筛选出具有一定应用前景的高活性候选物。

深入筛选：在温室条件下，开展作用方式(芽前/芽后、内吸/胃毒/触杀/熏蒸、保护/治疗等)、作用特性(吸收传导性、抗雨水冲刷性、持效/残效等) 和使用技术(施药适期、施药方式、使用剂量及环境影响因子)等研究，明确活性化合物的应用前景，为进一步的开发研究提供科学依据。

田间小区药效验证试验：在田间自然环境生态条件下，对筛选出的高活性化合物进行药效和安全性确认，以便开展进一步研究。

通过深入筛选和田间验证试验评价后的化合物为具有一定成药性的高活性候选物，继续开展相关研究。

1.1.3 高活性候选物筛选研究

主要开展高活性候选物在不同生态环境条件下，区域性多点的田间小区药效试验和使用技术研究，同时开展公斤级小试工艺、制剂研究和短期的健康和环境安全性评价等，综合评估其成药性。生测的主要研究内容：⑴ 通过靶标适合区域多点田间药效试验，初步确认施药方式/方法、施药适期、使用剂量及施药次数，明确施药间隔期、气候条件对施药的影响，以及对其他非靶标生物和后茬作物的影响等，初步确定其市场应用范围和准入点；⑵ 开展制剂配方的活性筛选，确定最佳稳定制剂产品，进行产品登记；⑶ 开展候选物与常规农药的混配联合毒力测定，为后续市场开发提供依据。

对高活性候选物及其制剂综合评估后进行登记开发，该阶段生测结果是决定其能否进入登记开发的关键要素。

1.2 创制开发阶段生物测定

开展候选物中试产品的使用技术研究，主要研究内容：⑴ 继续开展靶标适合区域多点田间药效试验，进一步确认施药方式/方法、施药适期、使用剂量、施药次数及抗性风险预测，明确施药间隔期、气候条件对施药的影响，以及对其他非靶标生物和后茬作物的影响等；⑵ 继续开展新制剂生物活性测定和组合物配方筛选，定位新靶标、新用途，提高产品性能；⑶ 通过开展靶标适合区域应用推广示范试验，助力其市场开发进程。

此阶段的田间药效试验和应用技术研究是决定农药产品登记和未来市场价值评估的关键。对区域性的试验数据进行系统总结，明确其市场应用推广技术要点及注意事项等，指导新产品的正确使用和合理布局；研究结果既是进行农药风险评估及风险管理决策的基础，也是进行农药登记残留试验中制定农药最大残留限量标准的基础；同时还明确药剂对作物及非靶标有益生物的影响，保证了环境生态安全。

同时通过对新制剂和组合物的生测筛选，有利于进一步扩大产品市场占有率，提高产品的市场竞争力。

1.3 产业化阶段生物测定

如何延长新产品在市场上的生命周期，使其有更长寿命，获得最大的经济效益，是该阶段生测技术研究的重点目标。

1.3.1 混配产品研发是延长产品寿命的基本手段

通过对前期的大量试验数据总结，掌握新产品特点，挖掘其自身潜力，结合农业生产中病、虫、草害发生情况和市场产品动态，开发混配制剂产品，扩大防治谱和使用范围，以提高产品市场占有率和竞争力。同时根据防治对象发生规律，研究新的使用方法，制定新的防治措施，如甲维盐[methylamino abamectin benzoate (salt)]作为广谱杀虫剂，普遍采用喷雾方法施用，但喷雾施用难以有效防治松材线虫病，而采用注干方法，防效达80%以上[4]。

1.3.2 抗性监测管理是延长产品寿命的重要手段

长期频繁使用某一种农药品种导致有害生物产生抗性。植物病、虫、草产生抗药性以后，再用这种药剂防治时，不仅药剂使用浓度、使用次数增加及防治费用成倍提高，而且还会加重农药对环境的污染和对有益生物的危害，缩短产品生命周期。为了延缓抗药性产生，通过农药抗性监测，进行抗性风险评估，制定抗性治理策略，也是农药生物测定的重要工作之一。不同作用机制的产品混配使用是抗性治理的措施之一，如氟环唑和吡唑醚菌酯混配，延缓了后者的抗性产生，延长了产品的使用寿命。

1.3.3 利用新技术和新理论延长产品生命周期

新农药研发具有周期长、投入多、风险高和回报高的特点，延长产品使用寿命是提高回报的重要途径。随着产品在农业生产中的频繁、长期使用，以及不断扩大的应用市场，需要新技术、新理论等手段解决药效减弱和环境安全等问题，以延长其生命周期。如草甘膦(glyphosate)的应用持续增长得益于孟山都公司转基因技术；汽巴-嘉基公司提出抗病激活剂(plant activator)理论；日本明治制果株式会社将烯丙苯噻唑(probenazole)应用于水稻育苗[5]，2011年销售额达到1.20亿美元，成为全球最大的抗病激活剂；巴斯夫公司开发的甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂吡唑醚菌酯(pyraclostrobin)，为了解决因其对水生生物的毒性而限制在水稻上的应用问题，公司开展大量的筛选研究，开发的新微囊悬浮剂配方中使用专利微胶囊技术，确保雾滴在水稻叶片上迅速释放，对病害产生最佳的预防和防治效果，而少量落入稻田水中的微胶囊迅速沉入底泥避免其对鱼类的暴露。研究中需要对微囊悬浮技术配方的每个参数进行大量的测试以确定其生物防效及其对水生生物的毒性潜力。此外，在田间推广试验中发现该药剂的促生作用后，研究发现该药剂作用机制独特，保健增产效果明显，成为全球第一个以“植物健康作用”登记的杀菌剂。当然这些新技术、新产品研发的关键环节需要研究新的生测技术给予相应评价。

2 我国创制农药生物测定研究进展

我国农药产业经过70年的发展，发生了翻天覆地的变化，目前我国已经成为农药生产大国和全球最大的农药出口国。2017年，农药产量已超过300万t，出口量超过150万t。我国农药经历了仿制为主、仿中有创、仿创结合、创制为主、自主创新的历程。20世纪 50年代后期，中国科学院上海有机化学研究所合成了乙基大蒜素(ethyl allicin)[6]，60年代沈阳化工研究院试制成功除草醚(nithophen)，从新中国第一个创制农药产品多菌灵(carbendazim)[7,8]，到我国首个获得中、美、欧等多国发明专利的创制农药品种氟吗啉(flumorph)[8,9]，创制农药品种陆续问世，到目前为止创制的农药品种有50多个。农药生物测定在农药研究中发挥着重大作用，近20年来，随着具有中国特色农药研发体系的形成和稳步发展，农药生物测定技术逐步完善，形成越来越科学的评价体系。

2.1 室内生物测定技术标准化

室内生测技术是研究作用物、靶标生物和反应强度三者关系的一项专门技术，是测定被试物在一定的环境条件下对试验靶标的作用。该技术对供试靶标生物、测试的环境条件、试验设计及结果分析等均提出了严格的要求。其首要条件就是培养标准化靶标生物，靶标生物的生理状态不同对作用物具有不同的反应，为了保证测定结果准确可靠，供试生物要有足够数量和良好质量。从20世纪90年代开始，政府和企业十分重视农药技术领域创新体系建设，加大研发投入，其关键的生测技术研究和体系建设得以快速发展。多家实验室建立了环境条件可控的养虫室、植物培养室、人工气候室和温室，规范了农业生产中发生的、具有代表性的有害昆虫、病原菌、杂草和卫生仓储害虫等靶标的培养方法，如小菜蛾[Plutella xylostella(Linnaeus)]、黏虫[Mythimna separata(Walker)]、苜蓿蚜(Aphis craccivoraKoch)、水稻褐飞虱[Nilaparvata lugens(Stal)]和朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinusBoiduval)等已经成为新药筛选的模式靶标。此外，农业重要害虫棉铃虫[Helicoverpa armigera(Hübner)]、甜菜夜蛾[Spodoptera exigua(Hübner)]和斜纹夜蛾[Spodoptera litura(Fabricius)]、桃蚜[Myzus persicae(Sulzer)]和西花蓟马[Frankliniella occidentalis(Pergande)]等均已实现常年累代饲养[10]。建立了杀菌剂生测靶标黄瓜霜霉病菌[Pseudoperonospora cubensis(Berk.et Curt.)Rostov.]、黄瓜白粉病菌(Erysiphe cichoracearumDC)和水稻纹枯病菌[Thanatephorus Cucumeris(Frank) Donk]等45种病原菌保存和培养方法[11]，并能保存和培养稗草[Echinochloa crusgalli(L.) Beauv]、牛筋草[Eleusine indica(L.) Gaertn.]和反枝苋(Amaranthus retroflexusL.)等70多种农田重要的禾本科、阔叶和莎草科杂草[12]。建立了规范的杀虫剂毒力测定方法50多种[10]，杀菌剂活体盆栽法20多种[11]，除草剂室内生测方法30 多种[12]。

为了保证试验方法的一致性，国家农业农村部从2006年开始，陆续发布行业标准《农药室内生物测定试验准则》《农药对作物安全性评价准则》《农药抗性风险评估》，对杀虫剂、杀菌剂、除草剂以及植物生长调节剂的室内生物活性、作物安全性、抗性风险评估试验方法进行了规范和统一。目前建立了《农药室内生物测定试验准则》行业标准杀虫剂14个(NY/T1154.1～14-2006)[13]、除草剂 11个(NY/T 1155.1～11-2006)[14]、杀菌剂 19 个(NY/T 1156.1～19-2006)[15]，建立农药对作物安全性评价行业标准3个[16]，建立农药抗性风险评估行业标准12个[17-19]。行业标准从试验靶标、仪器设备、试材准备、药剂配制、试验处理、试验调查、数据统计与分析等方面对农药室内生物测定进行了全面的规范，目前已成为我国开展农药室内生物测定试验的主要依据。

2.2 田间药效试验管理规范化

农药田间药效试验主要内容：⑴ 明确防治效果及应用技术试验，如农药新品种、新剂型的筛选试验，农药产品(包括不同制剂、复配制剂、农药混用等)之间效果比较试验，对有害生物的防治适期、最佳剂量和最佳施用次数的研究试验，不同使用方式及环境与耕作栽培条件对药效的影响试验等。⑵ 农药对试验作物的影响试验，如农药对作物安全性、产量、品质和抗逆性等的影响。⑶ 农药对邻近作物及天敌的影响试验，如农药对试验区域邻近作物的影响，主要是对天敌等非靶标生物的影响。

田间药效试验结果是进行农药产品市场应用价值评估、残留或其他登记试验剂量设置、市场经济效益分析、产品生命周期管理的关键数据。为了保证结果真实、准确、可溯源，田间药效试验质量规范管理非常重要。1985年FAO发布了《农药登记药效资料要求》，2002年FAO重新修订《农药销售和使用行为国际准则》对药效试验提出了相应要求，2006年 FAO制定《农药登记药效评审准则》[20]，要求药效试验遵循良好试验操作(Good Experimental Practice，GEP)。此外，1992 年 EPPO 发布“Standards for efficacy evaluation of plant protection products”，之后于1996年、2003年和2012年进行了修订。FAO和EPPO都对田间药效试验单位及人员、试验药剂、施药器械和条件、试验方案、试验程序、原始记录和结果分析等做了规范性要求，同时必须建立试验标准化操作规程(SOP)。

我国田间药效试验的规范和管理也在持续进行，先于2000年颁布《农药田间药效试验准则(一)》[21]，后于2004年颁布《农药田间药效试验准则(二)》[22]，制定了上百项农药登记田间药效试验准则，并陆续发布行业标准，指导登记农药田间药效试验技术。同时相继出台管理办法，如《农药登记药效试验认证管理办法》《农药登记田间药效试验报告编写要求》等，逐步要求试验单位遵循GEP。2014年，农业农村部农药检定所依据GEP要求，组织行业专家着手起草，并多次组织讨论“农药登记田间药效试验规范”，于2016年5月23日发布《NY/T 2885-2016农药登记田间药效试验质量管理规范》[23]。2017年2月8日，国务院通过新的《农药管理条例》，条例自2017年6月1日起施行。在此背景下，农业农村部发布2570号公告《农药登记试验质量管理规范》，加强并规范了包括田间药效试验在内的农药登记试验管理，确保了农药登记试验数据的完整性、可溯源和真实性。至此，我国农药药效试验管理与国际接轨。截止2020年2月5日，已经有81家试验机构获得符合《农药登记试验质量管理规范》的田间药效试验资质。

2.3 生物测定在新农药研发中逐渐成熟

我国农药生物测定起于20世纪60年代并逐步发展，在“九五”“十五”期间，形成以沈阳化工研究院、南开大学为依托单位的国家北方农药创制中心和以浙江省化工研究院、江苏省农药研究所、湖南化工研究院、上海农药研究所为依托单位的国家南方农药创制中心。同时，一些高等学校、科研院所及农药企业也建立了农药创新研究中心。科技部通过科技攻关计划，支持农药新品种创制研究、生测技术研究、创制农药生物活性筛选标准操作规程(SOP)体系建设研究，使我国农药生物测定技术和方法立足实际需求，本着“边建设边运行边出成果”的原则，建立了规范、系统、可行的农药生物活性筛选评价体系及操作规程。“十一五”“十二五”期间，国家科技支撑计划继续支持农药新品种创制和生物测定技术研究，通过生物测定技术研究课题，新增和规范了病、虫、草重要测试靶标的室内培养和生测筛选技术，开发了基于分子生物学的高通量筛选方法和微量快速筛选技术，对病、虫、草抗性靶标进行了抗性突变和机理研究，并将抗性靶标应用于反抗性农药筛选。在辽宁、浙江和湖南等地建立了规范化的田间试验示范基地，规范和完善了农药生物活性筛选技术体系。一些新靶标、新方法已经应用于新农药研究，提高了农药的创新能力和开发效率。经过多年的研究和实践积累，我国的生测技术取得突破性进展。

目前新化合物合成能力已达到3万个/年，生测筛选能力达到6万个/年[24]。筛选出我国具有自主知识产权的新农药品种近50个，其中四氯虫酰胺、氰烯菌酯、噻唑锌和喹草酮等新产品已经在农业生产中发挥着重要作用，还在开发过程中的新产品即将闪亮登场。

2.4 新农药登记管理中抗性风险评估备受重视

新农药使用2～20年，一些主要有害生物即出现抗性，全世界至少有600种害虫及害螨对一种或多种杀虫剂产生了抗性，其中小菜蛾、棉蚜和温室白粉虱等已对常用杀虫剂产生了较高的抗性水平[25]；从1992年至今，我国已有 44例抗性杂草报道，其中稗草、雨久花、日本看麦娘和播娘蒿等杂草抗性发展严重[26-28]；植物病原菌抗性更是不断发展，灰霉病菌、霜霉病菌及白粉病菌等已对多种药剂产生了不同程度的抗性[29]。吡虫啉是用于防治褐飞虱的第一个商品化新烟碱类药剂，邵振润等对多地稻飞虱进行检测，发现褐飞虱对其产生了严重的抗药性[30]。我国学者在监测水稻褐飞虱、白背飞虱对吡虫啉等烟碱类抗性的同时，对其交互抗性和抗性机制等均进行了研究[31-34]。

为了延缓有害生物抗药性的发展，需对农药的抗性风险进行评估和管理。1999年EPPO首次发布EPPO Efficacy evaluation of plant protection products——PP 1/213 (4) Resistance risk analysis，并分别于2002、2012和2015对其进行修订完善[35]。欧盟 (欧共体) 也早在2009年统一要求申请者在药物登记的过程中提供可能出现和抗性发生有关的信息。我国于2010年颁布了《农药抗性风险评估总则》，随后出台了 12条行业标准[17-19]，规范了抗药性评估方法。要求在登记新农药和涉及新使用范围的化学农药时，原则上应提供抗性风险评估资料。按杀虫剂、杀菌剂、除草剂分别建立应开展抗性风险评估的靶标生物和化合物清单，实行分类管理。

3 展 望

我国新农药创制起步较晚，“九五”期间在国家的大力支持下，建立了南北方6个农药创制研究基地生测中心，开启了为创制农药测定生物活性的研究之路。经过20余年的发展，从设施、设备到测试靶标、方法、活性评价标准和筛选模式等建立了基本符合我国农药生物活性筛选的平台，也组建了专业配套的研究队伍。近10年来，国内数家农药企业相继组建了农药生测研究团队，生物测定技术取得较大的进展。但是我国农药企业总体上在生测方面缺乏先进技术和设施，对生测的研发重视程度不够，人力和财力投入不足，与国际农药公司相比差距仍然很大。生测技术的适用性、先进性和系统性已成为制约我国绿色生态农药品种研发的瓶颈因素。

农药生物测定是一门重要的实用和实践科学，其研究内容随着农药的发展不断得到加强和丰富。农药研发定位惯以市场为导向，农业生产中发生的危害严重的病、虫、草就是新农药产品研发的市场所在。近年来，随着土地流转，农药不科学的频繁使用，农产品结构和耕作制度的改变，加之自然气候、环境条件变化，导致病、虫、草种群及其敏感性随之变化，抗药性持续加剧和低效药剂等问题突出，如稻飞虱、小菜蛾、白粉病、灰霉病、稗草和播娘蒿等有害生物的抗药性呈指数增长。2012-2016年对水稻褐飞虱田间种群抗药性监测结果显示，其对吡虫啉抗药性达132.0～8 478.0倍[36]。急需高效、低毒、无残留的农药新产品、新剂型产品投入市场。因此，需要研究和发展重要标准化的生测靶标、科学的试验方法和评价体系等技术。

近些年来，随着基因编辑、结构生物学、化学生物学和大数据智能化等技术发展，并向农药创新领域的渗透，催生了RNA干扰和免疫激活蛋白等全新机制农药。如孟山都公司开发出阻止害虫或病原基因表达、防治玉米虫害和病害的 RNA喷剂BioDirect；昆士兰大学研发出通过修饰植物基因表达提高抗病毒能力的 RNA喷雾农药 BioClay(LDH-dsRNA)。目前我国尚缺乏这些全新机制农药的生测技术。

总之，作为“眼睛”的发现新农药的生物测定技术面临极大的挑战。未来，随着人工智能、分子生物学、遗传工程技术、遥感定位系统和信息智能化的飞速发展，以及化学农药分子设计与作用机制研究的不断深入，相信越来越多先进的生测新方法、新技术将不断应用于我国绿色农药创新研究中，为绿色创制农药发现和科学使用提供关键支撑，为农产品提质增产保驾护航。