陕西枣疯病发病规律与苗木带病检测

吴 宽，田小曼

(杨凌职业技术学院 生物工程分院，陕西杨凌 712100)

枣原产于中国，已有8000余年的栽培历史。中国的大枣生产居世界领先地位，占世界总产量的99%。

1995年全国枣树栽植面积达到66.67万hm2，鲜枣总产突破7.8亿kg。2016年中国的枣树栽植面积达到150万hm2，主产区在山东、河北、山西、陕西、新疆、河南，占全国产量的90%，陕西盛产大枣，远销国内外。然而，随栽培面积扩大，生产上危害最大的枣疯病快速蔓延。长期以来，因对该病害的发生规律、品种抗病性研究较少，对病害缺乏有效的防治措施，全国每年因枣疯病死树高达千万株，直接经济损失高达数亿元，严重阻碍枣树产业的发展[1]。因此，对陕西枣疯病苗木带病检测与品种抗病性调查研究是枣生产中长期亟待解决的问题。

多年来，国内外已在枣疯病的发生危害、抗生素治疗、病原检测、以及枣树组培脱毒等方面开展了一些研究[2]。但是由于枣疯病植原体(Phytoplasma)严格寄生于植物的韧皮部，不能进行人工培养，因而对其病原基因组、致病分子机理、控制技术的研究都比较缺乏。到目前为止，除日本、韩国对枣疯病植原体的16S rDNA基因片段[3-4]有一些文献报道外，王海妮等[1]对枣疯病植原体16S rDNA基因序列和tuf基因的序列进行报道和分类地位鉴定，吴宽等[5]克隆枣疯病植原体核糖体蛋白基因(rp)并进行生物信息学分析。本研究开展陕西枣疯病苗木带病检测与品种抗病性调查，取得新的研究进展。现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材 料

2016-2018年对陕西彬县、佳县、清涧县等地的枣疯病发生现状、影响因素进行调查采样，分别采集枣树苗枝条165份，收集枣园酸枣枝条114份及枣树病树周围的中华拟菱纹叶蝉(Hishimonoideschinensis)、凹缘菱纹叶蝉(Hishimonussellatus)、大青叶蝉(Cicadellaviridis)、条沙叶蝉(Psammotettixstriatus)等样品30份。分子检测所用的pMD18-T simple vector、H.Q.&.Q凝胶回收试剂盒为优晶生物工程有限公司产品，Marker为DL-2000购于大连TaKaRa公司。EscherichiacoliJM109 菌株、枣疯病阳性对照均由西北农林科技大学植保学院分子病毒学实验室提供，分子检测在该实验室进行。

1.2 方 法

1.2.1 枣树苗木与昆虫样品总DNA的提取 参照文献[1,6]，取枣树和酸枣丛枝组织0.2 g，或昆虫样品5～6头，-80 ℃冰冻后充分研磨，加入0.5 mL DNA提取缓冲液(20 g/L CTAB、1.4 mol/L NaCl、100 mmol/L Tris-HCl pH8.0、50 mmol/L EDTA pH 8.0、φ=3% β-巯基乙醇、20 g/L PVP)和等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，在65℃水浴中保温提取30 min，冷却至室温后，12 000 r/min离心10 min，取上清液，再用等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提至蛋白除尽。上清液加入2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，沉淀先后用φ=70%乙醇和无水乙醇洗涤后，短暂干燥，加30 μL TE溶解DNA。-20 ℃冰冻保存，备用。

1.2.2 PCR扩增 根据文献[3,7]报道的植原体16S rDNA序列通用引物对R16mF2/R16mR1，R16F2/R16R2(由北京赛百盛公司合成)进行PCR扩增。引物对序列如下：R16mF2：5′- CATGCAAGTCGAACGGA-3′,R16mR1:5′-CTTAACCCCAATCATCGAC-3′,R16F2：5′-ACGACTGCTAAGACTGG-3′，R16R2：5′-CGG- GGTTTGTACACACCGC-3′，反应体系为25 μL。PCR 产物于10 g/L琼脂糖凝胶中电泳，经溴化乙锭染色后，在紫外透射灯下观察。

1.2.3 基因克隆与核苷酸序列分析 参考常规方法开展基因克隆[8]、分类鉴定[9-11]。 把含有目标外源片段的重组克隆送上海捷瑞生物技术有限公司进行序列测定，用BLAST 软件进行检索，采用Mega 6.0分析进化关系。

1.2.4 菟丝子传播 将盆栽的健康长春花苗置于菟丝子周围，将菟丝子的藤蔓一头缠绕其上，待菟丝子完全寄生长春花后，从菟丝子藤蔓另一头切断。将寄生菟丝子的长春花苗盆移至枣疯病株疯枝周围，悬挂固定，将菟丝子藤蔓缠绕在幼嫩疯枝上，保持传毒1.5个月。将长春花苗转移温室培养，除掉菟丝子，纱网防虫，观察长春花症状，PCR检测确定是否传毒成功。

1.2.5 嫁接传播 采用嵌芽法嫁接。剪取感染JWB长春花的病枝，切成1.5～2 cm茎段留1个叶柄作为接穗，在接穗芽下部的背面斜削一刀成马蹄形，再在另一面斜削长0.3～0.5 cm，成楔形，然后插入健康长春花砧木的“T”字形切口皮下，用塑料薄膜条缠紧，将植株置于阴凉处，2 d后放入温室，约2周后接穗成活。

2 结果与分析

2.1 枣疯病植原体16S rDNA基因的克隆与同源性分析

对2016-2018年采集的陕西彬县、佳县、清涧县的枣疯病样品总DNA进行巢式PCR扩增与测序，结果表明：PCR产物健康植株未扩增出特异性条带(图 1)，陕西彬县、佳县、清涧县3个枣区的枣疯病病原植原体的16S rRNA基因序列均为1.2 kb，3个产区没有株系分化现象。利用MEGA 6.0软件分析陕西3个JWB株系与国际基因库(NCBI)中韩国、日本、印度等13个JWB植原体株系16S rRNA碱基序列的同源关系，获得进化树(图 2)。结果显示，枣树JWB和酸枣枣疯病(WJWB)植原体16S rRNA高度一致，同源性达到99.9%，JWB与16S rⅤ组B亚组成员榆树黄化(EY)和悬钩子丛枝病(RuS)的同源性分别是98.5%和98.3%。可见其属于16SrⅤ组B亚组。

2.2 苗木带病分子检测

从彬县、佳县、清涧县采集的枣树苗木样品，采用植原体16S rDNA序列通用引物对R16mF2/R16mR1、R16F2/R16R2进行PCR分子检测，结果发现市场上的枣树苗部分带有枣疯病，以佳县枣树苗的带病率最高，达到7.69%，彬县带病率最低，为4.35%；枣园酸枣经过分子检测发现带病较多，以清涧县酸枣苗的带病率最高，达到 19.05%(表 1)。说明枣树苗隐性带病现象普遍，要选择无病、健壮枣树苗木建园是防止大面积发病的重要措施。

2.3 枣疯病发病规律研究

2016-2018年对陕西彬县、佳县、清涧县的枣疯病进行监测调查，结果表明：枣疯病每年5月中下旬开始表现症状，7月后症状逐渐明显，显现典型的簇状黄化、小叶、丛枝症状，伴有芽的不正常萌发和花器退化成叶片。1 a生发育枝的芽萌发成丛生枝、节间短、萎缩黄化。开花以后叶片发生明显病变，先是叶肉变黄，逐渐全叶黄化, 黄化后叶缘上卷，质地变脆，翠绿焦枯脱落，其他枝条叶片呈现黄绿相间的花叶(图3)。对叶片中提取的植原体16S rDNA条带检测发现，植原体在植物体内的含量呈现季节性波动，春夏季节幼嫩组织植原体含量较高，而秋冬季老叶片与树皮韧皮部组织，植原体含量会明显降低。同时，调查还发现枣园酸枣发病率高时枣疯病发生严重，说明通过昆虫介体枣疯病在枣树与酸枣间相互传播，酸枣枣疯病株已经成为枣园枣疯病的一个重要初侵染源。

2.4 品种抗病性调查

对陕西大枣主产区枣疯病调查结果显示，‘砘子枣’‘马牙枣’‘婆枣’发病率依次为19.38%、21.25%、25.32%，其次为‘酸铃枣’‘红平枣’‘黄河滩枣’‘长红枣’‘木枣’，发病率依次为 15.65%、14.47%、14.38%、13.75%和13.13%，‘晋枣’发病率最低，为11.18%。说明枣树品种间对枣疯病抗病性存在明显差异。 对‘晋枣’树龄与发病率关系调查发现，树龄的长短影响发病率，7～10 a 树龄发病率为3.15%～8.12%，15～20 a树龄发病率为9.26%～11.85%，有些老枣园达到 25.64%～31.36%。

M.标准DNA DL-2000 DNA marker；1～3.分别来自彬县、佳县、清涧县的枣树苗 Jujube stocks from Binxian, Jiaxian, Qingjianxian respectively；4～6.分别来自3个县的酸枣苗 Wild jujube stocks from 3 counties above； 7～10.分别来自3个县的健康枣树苗 Healthy jujube stocks from 3 counties above；9.阳性枣疯病株 Positive JWB stocks

图1 枣树苗木与酸枣中JWB植原体的PCR检测
Fig.1 PCR detection of JWB phytoplasma in stocks of jujube and wild jujube

图2 JWB植原体16S rDNA序列的同源进化树Fig.2 Dendrogram of JWB phytoplasma 16S rDNA sequences

枣区Jujube region彬县 Binxian枣树Jujube酸枣Wild jujube佳县 Jiaxian枣树Jujube酸枣Wild jujube清涧县 Qingjianxian枣树Jujube酸枣Wild jujube总株数 Total plants463852346742带病株数 Plants carrying JWB254658带病率/% Rate of diseased plants 4.3513.167.6917.657.4619.05

2.5 媒介昆虫带毒检测与传毒循环规律调查

在陕西彬县、佳县枣园采集的中华拟菱纹叶蝉(H.chinensis)、凹缘菱纹叶蝉(H.sellatus)、大青叶蝉(C.viridis)、条沙叶蝉(P.striatus)，用PCR检测带毒情况，结果显示，中华拟菱纹叶蝉、凹缘菱纹叶蝉携带枣疯病植原体，说明这两种叶蝉是陕西枣区枣疯病的媒介昆虫(图 3)。监测调查中华拟菱纹叶蝉、凹缘菱纹叶蝉的生活习性与传毒规律，发现在春季、夏季中华拟菱纹叶蝉、凹缘菱纹叶蝉主要生活在枣树上，在嫩叶上取食、产卵繁殖，同时，一些中华拟菱纹叶蝉、凹缘菱纹叶蝉转主寄生在枣园杂草或周边的胡萝卜、芹菜、茄子等作物上。进入秋季气温逐渐降低，一些媒介昆虫迁飞到地面杂草、三叶草、苜蓿、禾谷类作物上，在干草上产卵越冬，待春季气候温暖时孵化，叶蝉迁飞返回到枣树嫩叶上生活，完成生活史。同时，叶蝉从发病树取食携带病原，迁飞到地面中间寄主时将病害传播过去，来年春季叶蝉迁飞返回到枣树又将病原带回枣树，完成枣疯病的一个侵染循环。叶蝉通过持久性方式传播枣疯病，成虫和幼虫均能传病，雌雄交配后雌虫产的卵，植原体不能入侵，所以卵孵化的幼虫不再带毒。

2.6 菟丝子和嫁接传播

在温室内，采用菟丝子接种传毒，接种1.5个月，长春花表现丛枝症状，表明菟丝子将枣疯病从枣树病株传播到健康幼苗上(图4-A)。另外，将发病的长春花幼芽作接穗嫁接到健康长春花上，接种2个月后，健康长春花幼苗逐渐出现丛枝小叶症状(图4-B)，说明在长春花上嫁接能够传播枣疯病。

M. DL-2000 DNA marker; 泳道1.大青叶蝉C.viridis; 2. 中华拟菱纹叶蝉H.chinensis; 3. 条沙叶蝉P.striatus; 4. 凹缘菱纹叶蝉H.sellatus; 5. 健康菟丝子 Healthy dodder; 6～7. 菟丝子传播感染的长春花 Dodder-infected periwinkle; 8～9. 嫁接感染的长春花 Graft-infected periwinkle; 10. 健康长春花 Healthy periwinkle

图3 枣疯病植原体16S rRNA基因的PCR检测
Fig.3 PCR detection of 16S rRNA gene in JWB phytoplasma

A. 菟丝子传播感染的长春花 Periwinkle infected by dodder transmission; B.嫁接传播感染的长春花(左为嫁接，右为健康) Periwinkle infected by graft transmission (Grafted on left and healthy on right)

图4 枣疯植原体的菟丝子和嫁接传播
Fig.4 Transmission of JWB phytoplasma by dodder and grafted

3 讨 论

20 世纪50 年代以来，一些研究单位先后开展枣疯病的危害调查、病原存在部位的荧光观察、传毒昆虫种类鉴定、抗生素防治等试验，但是从分子水平上对枣疯病的苗木带病检测、初侵染源、果园病害循环、媒介昆虫生活史等方面进行的研究还比较少。本试验对陕西省3个主产区枣疯病的发生危害、核苷酸序列测定及病原进化关系、果园病害循环、品种抗病性、苗木带毒检测、菟丝子传播等进行研究，取得新的研究结果。

3.1 枣疯病病原的16S rRNA基因序列分析与病害侵染循环

对3个主产区枣疯病植原体16S rRNA基因序列分析，结果表明，目前陕西省3个主产区枣疯病植原体高度一致，没有分化；枣疯病植原体和酸枣丛枝病植原体病原一致，隶属于16S rⅤ组B亚组，与榆树黄化(EY)亲缘关系最近。分子检测证明中华拟菱纹叶蝉、凹缘菱纹叶蝉能够携带传播枣疯病。两种叶蝉的寄主有枣树、胡萝卜、芹菜、茄子、三叶草、苜蓿、禾谷类等。叶蝉从发病树取食携带病原，迁飞到地面中间寄主时将病害传播过去，来年春季叶蝉迁飞返回到枣树又将病原带回枣树，完成枣疯病的一个侵染循环。

3.2 苗木带毒与菟丝子传播检测、品种抗病性 调查

从彬县、佳县、清涧县采集的枣树苗样品，采用植原体16S rDNA序列进行PCR分子检测，结果发现，市场上出售的枣树苗带病普遍，以佳县枣树苗的带病率最高，达到7.69%，彬县带病率最低，为4.35%；枣园酸枣带病较多，以清涧县酸枣苗的带病率最高，达到19.05%，说明枣树苗隐性带病普遍，所以，建议对枣园周边的酸枣，要每年清除，清洁田园，减少初侵染源。新建枣园时，要选择脱毒、健壮枣树苗木栽植，以防止大面积发病。另外，避免在枣园周边种植蔬菜、苜蓿、牧草、果树，阻断枣疯病传播介体的转主寄主与越冬场所，远离枣疯病的带毒寄主，减少循环侵染，为枣疯病的持续控制提供技术支撑。