北京地区枣疯病植原体潜在介体叶蝉种类筛查

代丽珍，郭家洛，冯玉环，王 龙，郝少东，郭 力，杨宝东，任争光，王进忠

(北京农学院植物科学技术学院/农业应用新技术北京市重点实验室,北京 102206)

植原体(Phytoplasma)原称为类菌原体(Mycoplasma-Like Organism，简称MLO)，无细胞壁，可寄生于昆虫体内和植物的韧皮部。取食韧皮部的昆虫有可能感染并传播植原体。然而，在取食寄主植物韧皮部昆虫类群中，只有少部分种类确定是植原体介体昆虫，目前主要分三组：第一组是所有已知介体种类最多的叶蝉科昆虫；第二组为蜡蝉次目4个科昆虫；最小一组是木虱科2个属昆虫[1]。在叶蝉科昆虫中，已有很多种类被确认为植原体介体昆虫[2]。如条沙叶蝉(PsammotettixstriatusLinnaeus)为小麦蓝矮病植原体的介体昆虫，可将该植原体传播给翠菊、长春花、番茄等多种植物[3-4]。黑面叶蝉(Graminellanigrifrons)可同时将CandidatusPhytoplasma asteris和CandidatusPhytoplasma fraxini这2种植原体传播给桃、杏、李子和梨等果树[5]。另外，Euscelidiusvariegatus和Macrostelesquadripunctulatus这2种叶蝉可获取并传播菊花黄化植原体[6]。尖鼻叶蝉(ScaphytopiusmagdalensisProvancher)是传播蓝莓矮化植原体的介体昆虫[7]。新东方叶蝉(Orientusishidae)被确定为传播葡萄金黄植原体Flavescence dorée的潜在介体[8]。

枣疯病(Jujube witches’-broom disease JWB)又称枣树丛枝病，是一种危害严重的检疫性病害，具有较强的侵染性和流行性，在中国枣产区普遍发生[9]。近年来该病害在北京地区流行并对古枣树形成严重威胁，已对北京密云金丝小枣造成毁灭性的破坏[10]。枣疯病由寄生于枣树韧皮部的植原体引起[11-12]。凹缘菱纹叶蝉(HishimonussellatusUhler)是中国枣疯病、桑矮缩病的重要介体昆虫和传染源[13-14]。尽管过去许多学者对枣疯病的病原生物学和防治进行大量探索[15-20]，但是目前对枣疯病植原体介体昆虫研究，特别是潜在介体叶蝉种类报道甚少。

介体昆虫携带植物病原体的流行直接依赖于其介体种类及生态策略，例如其休眠时间，寄主特异性，摄食偏好性及其扩散能力等[1]。然而，解决任何媒介传播病害流行病学循环的基础是对介体种类的准确鉴定和检测[21]。多年来，一些学者认为中华拟菱纹叶蝉(H.chinensisAnufriev)和凹缘菱纹叶蝉(H.sellatus)是枣疯病的主要介体昆虫[14,22]。然而Hao等发现北京地区枣园菱纹叶蝉种群实际上是凹缘菱纹叶蝉(H.sellatus)和片突菱纹叶蝉(HishimonuslamellatusCai et Kuoh)的混合种群，二者仅从外部形态上难于区别[23]，所以弄清北京地区枣园叶蝉种类和类群，筛查感染植原体的种类，明确与枣疯病流行相关的介体昆虫种类，对于探索预防枣疯病流行危害具有重要的实践意义。

本研究目的是筛查北京地区枣园感染疯病植原体叶蝉种类，确定枣疯病植原体的潜在叶蝉介体，为预防和控制枣疯病流行提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 研究地点

昆虫标本采集地点位于北京地区的昌平区流村镇流村、海淀区西北旺镇唐家岭村、朝阳区奥林匹克森林公园、通州区永于路北京观光南瓜园。

1.2 标本采集

2016年9月中旬至2018年11月底期间在采集地点，使用20 cm×25 cm双面黄色粘虫板(北京格瑞碧源科技有限公司)进行叶蝉诱集取样。粘虫板被放置树冠处(地上1.5 m)。同时，在已发生枣疯病症状的枣树上，采用扫网法，每次扫网10余次，收集叶蝉科昆虫。

1.3 种类鉴定

形态鉴定，对昆虫标本进行分类，保留叶蝉。从黄色粘虫板上取出叶蝉，用甲苯处理5 min，然后用无水乙醇处理5 min，以确保叶蝉中水分完全去除。将样本保存在75%乙醇中直至鉴定。根据杨茂发等的《中国动物志 昆虫纲 第六十七卷》、崔俊芝等的《中国昆虫模式标本名录 第2卷》、葛钟麟的《中国经济昆虫志 第十册》、虞国跃等的《王家园昆虫》对属或物种水平进行鉴定。其中，菱纹叶蝉种类鉴定采用雄性外生殖器解剖和分子鉴定相结合方法，采用本实验室已建立的多重PCR法区分枣园2种菱纹叶蝉[23]。

1.4 叶蝉感染枣疯病植原体检测

1.4.1 试剂及仪器 DNA Marker(DL2000)，购自宝生物工程(大连)公司；2×Taq MasterMix(Dye)购自北京康为世纪生物科技有限公司；微量标本基因组提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；引物委托生工生物工程(上海)有限责任公司合成；TE buffer购自北京索莱宝科技有限公司；其他生化试剂均为国产分析纯；手持研磨器购于金银杏生物科技(北京)有限公司，YLE-1000恒温水浴锅，Eppendorf Centrifuge 5417R离心机，DYY-8C型电泳仪(北京市六一仪器厂)，SN-Lab Transiluminator SN-NJ0601凝胶成像紫外分析仪(北京信诺莱伯仪器有限公司)，G-Storm 自动热循环仪(GRI公司)。

1.4.2 从昆虫中提取DNA 取单头叶蝉，放在加有适量液氮的1.5 mL 离心管中，用无菌研磨棒磨成粉末，按微量标本基因组提取试剂盒说明书步骤进行基因组DNA提取，用30 μL TE buffer融解DNA[24]。

1.4.3 PCR扩增 使用植原体通用引物，P1(5′-AAGAGTTTCCTGGCTCAGGATT-3′)/P7(5′-CGTCCTTCATCGGCTCTT-3′)。在10 μL 2×Taq PCR Master Mix、0.6 μL每种引物(正向和反向)、7.8 μL ddH2O和1 μL模板DNA的20 μL反应体系中进行PCR扩增。PCR反应在G-Storm中进行。95 ℃预变性5 min，35个循环(94 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸160 s)，最后延伸步骤72 ℃10 min。通过在1%琼脂糖凝胶中电泳分离PCR产物，并用溴化乙锭染色[25-26]。

2 结果与分析

2.1 枣园内叶蝉种类分析

在2016年9月中旬至2018年11月期间，共收集999头叶蝉，其中826头已进行分类。收集的叶蝉属于6个亚科13个种，见表1。

海淀区西北旺镇唐家岭村以及昌平区流村镇流村叶蝉种类中，分布如下：殃叶蝉亚科Euscelinae的片突菱纹叶蝉(HishimonuslamellatusCai et Kuoh)、凹缘菱纹叶蝉(H.sellatus)、一点木叶蝉(PhlogotettixcyclopsMulsant et Rey)、横带叶蝉(ScaphoideusfestivusMatsumura)，大叶蝉亚科Tettigellini的大青叶蝉(CicadellaviridisLinnaeus)和白边大叶蝉(KollapaululaWalker)，小叶蝉亚科Typhlocybinae的小绿叶蝉(Empoascaspp.)、斑叶蝉(Erythroneurasp.)和红闪小叶蝉(Zyginasp.)，叶蝉亚科Iassinae的新县长突叶蝉(BatracomorphusxinxianensisCai et Shen)，角顶叶蝉亚科Deltocephalinae的条沙叶蝉(P.striatusLinnaeus)，耳叶蝉亚科Ledrinae(Scarinae)的窗耳叶蝉(LedraaudituraWalker)。

片突菱纹叶蝉(H.lamellatus)，凹缘菱纹叶蝉(H.sellatus)在4个调查地点均有分布。海淀区西北旺唐家岭村收集的菱纹叶蝉中，凹缘菱纹叶蝉(H.sellatus)的数量明显多于片突菱纹叶蝉(H.lamellatus)，而朝阳区奥林匹克森林公园收集的菱纹叶蝉情况则与之相反，片突菱纹叶蝉(H.lamellatus)数量明显多于凹缘菱纹叶蝉(H.sellatus)。

小绿叶蝉(Empoascaspp.)数量最多，其次是片突菱纹叶蝉(H.lamellatus)和凹缘菱纹叶蝉(H.sellatus)。横带叶蝉(S.festivus)和一点木叶蝉(P.cyclops)则相对较少。大青叶蝉(C.viridis)在海淀区西北旺镇唐家岭及昌平区流村镇流村均有分布，且昆虫数量高于白边大叶蝉(K.paulula)。

叶蝉亚科Iassinae的新县长突叶蝉(B.xinxianensis)则只在昌平区流村镇流村被诱集到。角顶叶蝉亚科Deltocephalinae的条沙叶蝉(P.striatus)虽然数量较少，但在海淀区西北旺镇唐家岭及昌平区流村镇流村均有分布。耳叶蝉亚科Ledrinae(Scarinae)的窗耳叶蝉(L.auditura)则只在海淀区西北旺镇唐家岭村经扫网收集到1头

2.2 PCR检测叶蝉体内的枣疯病植原体

在对枣疯病植原体的调查中，诱集并鉴定12个叶蝉属(表2)。使用通用植原体引物对P1/P7进行PCR分析，扩增子约为1 800 bp大小。在2个亚科的3个属的标本DNA提取物中检测到与阳性样品相同大小的产物。

菱纹叶蝉属Hishimonus的2个物种均存在感染枣疯病植原体的情况。共检测71头片突菱纹叶蝉(H.lamellatus)，其中1头PCR检测呈阳性(图A-7)，感染率为1.4%(表2)。在检测的132头凹缘菱纹叶蝉(H.sellatus)中，4头呈阳性(图A-10)，其感染率为3.0%(表2)。

表1 北京地区4个调查地点收集的叶蝉种类Tab.1 Leafhopper species collected at four survey sites in Beijing

注：部分标本不完整，无法辨别雌雄。

Note： Some specimens are incomplete and cannot be distinguished from males and females.

表2 叶蝉感染枣疯病植原体PCR检测结果Tab.2 PCR detection of the Leafhoppers infected with jujube witches’-broom phytoplasma

共检测大叶蝉属Cicadella的大青叶蝉(C.viridis)(图B-11)27头，2头标本呈阳性，其感染率为7.4%(表2)。检测边大叶蝉属Kolla的白边大叶蝉(K.paulula) 12头，其中1头标本呈阳性，感染率为8.3%(表2)。

注：(A)M，2 000 bp Marker，1-6凹缘菱纹叶蝉(H. sellatus)，7-10片突菱纹叶蝉(H. lamellatus)，11阴性对照，12阳性对照，1 800 bp枣疯病植原体的扩增产物条带；(B)M，2 000 bp Marker，1-5小绿叶蝉(Empoasca spp.)，6-7横带叶蝉(S. festivus)，8-10桃一点叶蝉(S. shinshana)，11大青叶蝉(C. viridis)，1 800 bp枣疯病植原体的扩增产物条带；(C)M，2 000 bp Marker，1-2红闪小叶蝉(Zygina sp.)，3大青叶蝉(C. viridis)，4-6小绿叶蝉(Empoasca spp.)7-10白边大叶蝉(K. paulula)，11阴性对照，12是阳性对照，1 800 bp枣疯病植原体的扩增产物条带。Note:(A)M, 2 000 bp Marker, 1-6 H. sellatus, 7-10 H. lamellatus, 11 Negative control, 12 Positive control, amplicon of Phytoplasma of jujube (1 800 bp); (B)M, 2 000 bp Marker, 1-5 Empoasca spp., 6-7 S. festivus, 8-10 S. shinshana, 11 C. viridis, amplicon of Phytoplasma of jujube (1 800 bp); (C)M, 2 000 bp Marker, 1-2 Zygina sp., 3 C. viridis, 4-6 Empoasca spp., 7-10 K. paulula, 11 Negative control, 12 Positive control, amplicon of Phytoplasma of jujube (1 800 bp).图1 几种叶蝉DNA聚合酶链式反应扩增的琼脂糖凝胶(1%)电泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis (1%) of PCR products obtained from DNA extracts of several leafhopper species

3 讨 论

对2016年9月中旬至2018年11月期间北京地区枣园中采集的叶蝉进行鉴定和感染枣疯病植原体的叶蝉进行筛选，初步明确北京地区枣园枣疯病植原体潜在介体叶蝉种类；在调查的4个地点中均有凹缘菱纹叶蝉(H.sellatus)及片突菱纹叶蝉(H.lamellatus)发生。这些结果与郝少东等[24]发现在北京地区枣园内凹缘菱纹叶蝉(H.sellatus)及片突菱纹叶蝉(H.lamellatus)混同发生，且在两者体内已检测出植原体结果相一致。一些学者认为凹缘菱纹叶蝉(H.sellatus)是枣疯病植原体的介体昆虫[14]，但未对菱纹叶蝉种类和植原体进行分子鉴定和检测，本试验对采集的菱纹叶蝉成虫逐一进行PCR鉴定和雄性外生殖器确定，对每一叶蝉个体感染的植原体分别进行分子检测，明确枣园混合发生近缘物种菱纹叶蝉自然感染率，为进一步确认其传播枣疯病奠定基础。

据报道，大青叶蝉(C.viridis)可传播导致欧洲石果黄化病的欧洲石果黄化病植原体European stone fruit yellows，白边大叶蝉(K.paulula)可传播葡萄皮尔斯病(Pierce's disease)[25-27]。白边大叶蝉(K.paulula)及黑尾大叶蝉(BothrogoniaferrugineaF.)已证明是葡萄黄化病和皮尔斯病的介体昆虫[28]。本研究表明，大青叶蝉(C.viridis)和白边大叶蝉 (K.paulula)均被检测为阳性，是枣疯病植原体的自然携带者，说明2种叶蝉可能为枣疯病植原体潜在介体昆虫，是否能传播枣疯病需要进一步试验证明。

据报道，其他刺吸类昆虫也发现是植原体的介体昆虫。如马铃薯木虱(Bactericeracockerelli)是CandidatusLiberibacter solanacearum的介体昆虫，可将其传播到茄科植物如马铃薯、番茄、茄子中，导致马铃薯毁灭性斑马片病害[29]。胡萝卜木虱(BactericeratrigonicaHodkinson)可将葡萄黄化植原体传播给胡萝卜[30]。另外，梨木虱(Cacopsyllapyri)通过传播梨衰退植原体引起梨树衰退病[31]。另一木虱Cacopsyllapyricola被确定为桃黄化卷叶病植原体介体昆虫[32]。FieberiellafloriiStål被证明为苹果丛生植原体(CandidatusPhytoplasma mali)的介体昆虫[33]。枣疯病植原体的介体昆虫是否存在其他潜在半翅目昆虫还有待研究证实。

植原体的分化和分类依赖于保守基因的分子分析，特别是16S rRNA[34-35]。核糖体RNA操纵子成为测序的优选靶标[34,36]。聚合酶链反应(PCR)为植原体检测提供灵敏的工具[37-38]。虽然昆虫物种中植原体的检测不能证明两者是否为媒介关系，但该技术可用于缩小对许多分类群中潜在介体叶蝉的搜索范围。

4 结 论

北京地区枣园枣树存在片突菱纹叶蝉(H.lamellatus)与凹缘菱纹叶蝉(H.sellatus)混同发生的情况，且在2种叶蝉体内检测到枣疯病植原体，凹缘菱纹叶蝉(H.sellatus)、片突菱纹叶蝉(H.lamellatus)可能为潜在的枣疯病植原体介体。

值得注意的是，经PCR检测本研究首次发现大青叶蝉(C.viridis)与白边大叶蝉(K.paulula)呈阳性，很有可能是枣疯病植原体潜在的介体叶蝉。其他叶蝉经检测未发现感染植原体。

致谢

感谢蔡平教授、戴武教授、戴仁怀教授鉴定叶蝉物种方面所做的工作。感谢农业应用新技术北京市重点实验室张卿、杨瑞和杨柳对显微照相的帮助。