茶树精油对金黄色葡萄球菌抗菌作用的研究

曹 硕，刘 倩，张 昊，王 朕，沈 红，张永红

(北京农学院动物科学技术学院/兽医学(中医药)北京市重点实验室/动物类国家级实验教学示范中心(北京农学院)，北京 102206)

植物精油具有多种生物活性，迷迭香精油是迷迭香次生代谢物质。研究发现，迷迭香精油除含有香气成分,还含有很多药用成分,如抗菌、抗感染物质、抗氧化物质、调节抗癌物质和天然色素等[1]。与迷迭香同科属的薰衣草，其精油具备较为强烈的芳香气味，具有镇静催眠功能和抗抑郁狂躁特点，还有研究发现薰衣草具有抗菌、抗氧化、抗凝血性的功能。茶树是一种同时兼有欣赏价值、香料价值和药用价值等多种价值属性的植物，茶树精油(Tea Tree oil)是桃金娘科(Myrtaceae)白千层属(Melaleuca)灌木树种-互叶白千层(Melaleucaalternifolia)的新鲜枝叶经水蒸气蒸馏得到的芳香精油[2]，其具有独特的香气。茶树精油具有很强的抗菌效果，是极具价值和发展潜力的纯天然植物精油[3]。近年来，对于精油治疗功效的体内研究大多是用芳香疗法，通过嗅觉通路观察茶树精油对大脑功能的影响，很少有研究涉及到茶树精油的抗菌作用。本研究采用药敏试验确定茶树精油的抑菌作用，通过小鼠感染金黄色葡萄球菌建立肺炎模型，模型小鼠经鼻吸入茶树精油，通过分析体重、血常规、脏器指数、组织病理变化、肺脏细菌定殖率等指标，探讨茶树精油通过小鼠嗅觉通路对患肺炎的小鼠影响，为其未来开发应用提供试验参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌购于中国兽药监察所，茶树精油、MHB培养基与琼脂粉购于北京奥博星生物技术有限责任公司，小鼠白介素6(IL-6)试剂盒购自中国湖北伊莱瑞特生物科技有限公司。Leica EG1150石蜡包埋机、Leica RM2235型切片机(德国Leica公司)，WFZ-UV-2000型紫外可见分光光度计(尤尼柯(上海)仪器有限公司)，MEK-7222K五分类血细胞分析仪(日本NIHON KOHDEN公司)。42～56日龄健康昆明小鼠、体重20～22 g，购于中国军事医学科学院实验动物中心(SCXK-(京)2016-0002)。

1.2 方 法

1.2.1 菌悬液制备 称取4.8 g粉末MHB琼脂培养基加到锥形瓶中并加纯水200 mL溶解，密封锥形瓶置于高压灭菌锅内灭菌，备用。取200 μL金黄色葡萄球菌菌液加入已灭菌的MHB锥形瓶中，置于摇床过夜摇10 h，然后取适量过夜菌加到新的培养基中摇6 h，分光光度计检测其OD值，根据公式y=1.25x+7.0115(x=OD值)，计算菌落数为1×10yCFU/mL。

1.2.2 药敏试验 按照文献[4]制备MHB固体培养基，采用涂布法分别将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌液涂在平皿培养基上，且保证菌液渗透于MHB固体培养基，然后将浸有精油的药片轻放于涂菌后培养皿相应的区域。

1.2.3 小鼠分组与其感染金黄色葡萄球菌的模型建立 取小鼠随机分对照组、模型组、茶树精油组；将小鼠固定麻醉，然后模型组和茶树精油组小鼠滴鼻感染金黄色葡萄球菌(2×109CFUs/只)，待小鼠完全吸入菌液后，使其平躺至苏醒；对照组小鼠滴鼻等量PBS。

1.2.4 茶树精油处理小鼠 小鼠滴鼻感染细菌2 h后开始吸嗅茶树精油。

吸嗅方法：首先将盛有2 mL茶树精油离心管固定于小鼠玻璃罩中上部，打开离心管茶树精油挥发弥漫玻璃罩内，然后将茶树精油组小鼠置于罩内使小鼠吸嗅茶树精油30 min，每天2次连续7 d；同样方法将模型组和对照组小鼠置于玻璃罩内30 min，但不吸嗅任何精油。

1.2.5 小鼠称重及计算肺脏指数 所有小鼠感染前(0 d)称重，然后分别于1、3、5、7 d称重，同时每组随机取4只小鼠采血，颈椎脱臼处死，打开腹腔肉眼观察脏器大小及色泽等，摘取肝、肺、肾、脾脏器称重及拍照。

1.2.6 小鼠血常规及细胞因子检测 试验结束后小鼠采血，取部分血液离心制备血清，按照试剂盒说明检测IL-6；另一部分血液用于血细胞分析仪分析小鼠血常规指标。

1.2.7 细菌定殖肺脏情况检测 无菌条件取部分肺脏组织称重，然后置于灭菌匀浆器内，加2 mL无菌PBS快速匀浆、离心，取定量上清匀浆液涂抹于MHB固体培养基上，37 ℃生化培养箱过夜培养24 h，最后记录培养皿内菌落数，按照每毫克肺脏体重，计算肺脏细菌定殖数。

1.2.8 肺脏组织切片的制作与观察 取肉眼观察疑似病变肺组织，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋、切片、脱蜡、苏木精/伊红染色，显微镜观察、拍照。

1.2.9 统计分析 试验数据以平均数±标准差表示，采用t检验分析比较各组数据，方差不齐时用t’检验，用*和△表示P<0.05即差异显著，用**和△△表示P<0.01即差异极显著。

2 结 果

2.1 茶树精油对常见病原菌的抑菌活性分析

按照文献[5]抗生素抑菌效果判定标准：抑菌圈直径>15 mm为最敏感，10～15 mm为中度敏感，7～9 mm为低度敏感，无抑菌圈为不敏感[3]。本试验采用纸片扩散法检测迷迭香精油、茶树精油、薰衣草精油的抑菌活性，薰衣草精油组几乎未有抑菌圈，茶树精油组精油对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌抑菌圈直径分别为12 mm±2.3 mm和10 mm±1.9 mm，呈现良好的抑菌活性，表明金黄色葡萄球菌和大肠杆菌对茶树精油为中度敏感；图1显示茶树精油原液有抑菌圈，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌有抑菌效果，但茶树精油经5、10和20倍稀释后没有抑菌圈(图2)。

注:M迷迭香精油、C茶树精油、X薰衣草精油。Note: M rosemary, C tea tree, X lavender.图1 不同植物精油对金黄色葡萄球菌(A)和大肠杆菌(B)的抑菌效果Fig.1 Bacteriostatic effects of different plant essential oils on Staphylococcus aureus (A) and E.coli (B)

注：1为茶树精油原液，2、3、4分别为5、10、20倍稀释的茶树精油。Note: 1 means tea tree stock solution, 2 means 5-fold dilution, 3 means 10-fold dilution, 4 means 20-fold dilution.图2 不同稀释度的茶树精油对金黄色葡萄球菌(A)和大肠杆菌(B)的抑菌效果Fig.2 Antibacterial effects of different dilutions of tea tree oil on Staphylococcus aureus (A) and E.coli (B)

2.2 小鼠体征变化

试验过程中观察小鼠体征变化，对照组小鼠无异常体征变化，模型组和茶树精油组小鼠在感染细菌后开始表现反应强烈，暴躁喜斗，采食减少，大便干结；但茶树精油组小鼠吸嗅茶树精油后表现较为温和，进食量增加，尿量增多，体征情况逐渐好转并恢复至正常。

2.3 茶树精油对小鼠体重和肺脏指数的影响

试验过程中对不同时间处理的小鼠称重，结果随着饲养时间延长，对照组小鼠平均体重逐渐增加，均高于模型组和茶树精油组；模型组小鼠体重第1天降低、第3天后体重逐渐升高；茶树精油组从第1天至第7天小鼠体重逐渐增加且呈上升趋势，高于模型组但低于对照组(图3)。

注：与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01；与对照组相比，△P<0.05,△△P<0.01。Note: *P<0.05, **P<0.01 compared with model group, △P<0.05, △△P<0.01 compared with control group.图3 茶树精油对金黄色葡萄球菌感染的小鼠体重影响Fig.3 Effects of tea tree oil on the body weight of the mice with pneumonia infected by Staphylococcus aureus

小鼠肺脏指数变化结果见图4，模型组小鼠肺脏指数逐渐提高；茶树精油组小鼠肺脏指数低于模型组，且小鼠感染细菌第3天至第7天时小鼠肺脏指数接近对照组(图4)。

注：与模型组相比，*P<0.05， **P<0.01；与对照组相比，△P<0.05,△△ P<0.01。Note: *P<0.05, **P<0.01 compared with model group, △P<0.05, △△P<0.01 compared with control group.图4 茶树精油对小鼠肺脏指数的影响Fig.4 Effects of tea tree oil on lung index of the mice

2.4 茶树精油对小鼠炎性细胞及炎症因子的影响

采用血细胞分析仪检测小鼠感染细菌7 d内血液中炎性细胞数量，对照组小鼠血液中白细胞数量在1～7 d一直保持相对较低且不变动，模型组小鼠白细胞数逐渐增加且显著高于对照组，而茶树精油组白细胞数第1天高于对照组并与模型组相近，随后逐渐降低，第3天接近对照组，第7天升高接近模型组(图5A)；小鼠血液中中性粒细胞数总体变化趋势与白细胞一致，对照组小鼠中性粒细胞数一直保持相对稳定，但显著低于第1天和第7天模型组，茶树精油组第3天小鼠中性粒细胞数明显降低，且显著低于模型组(图5B)。

采用ELISA方法检测小鼠血清中IL-6含量，结果对照组小鼠血液IL-6含量从第1天到第7天一直保持相对稳定低于模型组和茶树精油组，而茶树精油组小鼠第1天血清中IL-6含量略有升高，第3天降低之后一直保持稳定水平，且在第3天到第7天低于对照组(图6)。

注：与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01；与对照组相比，△P<0.05,△△P<0.01。Note: *P<0.05, **P<0.01 compared with model group, △P<0.05, △△P<0.01 compared with control group.图5 茶树精油对小鼠血液中炎性细胞的影响(A白细胞，B中性粒细胞)Fig.5 Effect of tea tree oil on inflammatory cells in blood from the mice (A white blood cell, B neutrophil)

图6 茶树精油对小鼠血液中IL-6的影响Fig.6 Effect of tea tree oil on IL-6 contents in bloods from the mice

2.5 茶树精油对金黄色葡萄球菌定殖小鼠肺组织的影响

试验过程中检测小鼠肺组织中金黄色葡萄球菌量，模型组小鼠感染细菌后1～3 d内每毫克肺组织中金黄色葡萄球菌的菌落数较高，第5天和第7天其菌落数极显著降低；茶树精油组小鼠第1天肺组织中菌落数较高，随后菌落数逐渐降低，第3天到第7天显著减少；对照组小鼠肺组织中细菌数一直保持相对稳定(图7)。

2.6 茶树精油对小鼠肺组织结构的影响

试验结束打开小鼠腹腔肉眼观察肺脏变化，与对照组相比，模型组小鼠感染细菌1 d后，肺脏肿胀充血，色泽暗红，肺叶上均有大小不等和形状不同的出血斑，肺组织出现肿块变硬，肺门淋巴结肿大、出血；茶树精油组小鼠连续7 d吸嗅茶树精油后，肺脏形态出现好转、出血斑减少、充血减弱，第7天的肺脏颜色变浅呈现淡粉色，质地变软(图8)。

图7 茶树精油对金黄色葡萄球菌定殖小鼠肺脏的影响Fig.7 Effects of tea tree oil on Staphylococcus aureus colonizing in the mice lung

肺组织切片HE染色，与对照组比较，模型组小鼠感染细菌后肺组织呈现大量充血，肺泡壁增厚，肺泡组织结构完整性破坏，肺泡腔内可见出血；与模型组比较，茶树精油组小鼠连续吸嗅茶树精油后，肺组织充血减轻，肺泡壁较厚，肺泡结构完整性逐步恢复(图9)。

图8 小鼠肺脏剖检肉眼观察变化Fig.8 Visual observation changes of mouse lung biopsy

图9 HE染色小鼠第3天肺组织 (100×)Fig.9 HE staining lung tissues from the mice on the third day (100×)

3 讨 论

3.1 茶树精油对金黄色葡萄球菌的体内外抗菌效果

研究表明，植物精油具有多种生物活性，且具有抗菌作用。汤奕越[6]利用纸片扩散法检测肉桂精油、月桂精油及茶树精油对临床常见病原菌的抑菌活性，茶树精油对所试菌株(鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、产气肠杆菌、肺炎克雷伯菌、屎肠球菌及粪肠球菌)抑菌作用较弱。胡忆雪[7]等采用茶树精油对3种痤疮致病菌(痤疮丙酸杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌)进行定性、定量的抗菌性分析，茶树精油对3种痤疮致病菌均具有良好的抑菌作用,其中对金黄色葡萄球菌的MIC值为0.15 μL/mL。茶树精油对体外大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌有一定的抑菌作用，其抑菌圈>10 mm；体内试验发现小鼠吸入茶树精油后肺部细菌定殖数显著降低，结果与报道基本一致。

3.2 茶树精油对金黄色葡萄球菌感染的小鼠肺组织的影响

Morsoleto等[8]研究表明，茶树精油可以通过减少炎症浸润促进损伤肌肉的恢复。本试验发现，感染金黄色葡萄球菌小鼠连续吸嗅茶树精油7 d后，小鼠肺组织充血减轻，肺泡间隙炎性细胞浸润减少，肺泡结构完整性逐步恢复，这可能是茶树精油抑菌作用的结果。体重是动物试验中一个重要的非特异性观察指标[9]，而以器官重量与体重之比得到的脏器系数是生物医学研究中常用的重要数据[10]，脏器系数高低变化意味着组织器官正常情况[11]。本研究检测感染金黄色葡萄球菌的小鼠脏器指数，结果只感染细菌的模型组小鼠体重明显减轻，肺脏指数升高，而感染细菌的小鼠吸嗅茶树精油后，其肺脏指数逐渐降低接近对照组，说明茶树精油呈现的抑菌作用能缓解小鼠肺部炎症，其作用机理还不清楚有待研究。

3.3 茶树精油对金黄色葡萄球菌感染小鼠致炎因子及炎性细胞的影响

IL-6是炎症急性期合成的重要介质，作为一种重要的非特异性炎症因子，促进炎症反应和组织损伤[12-13]；肺炎时致炎因子能激活中性粒细胞和单核细胞释放一些炎性细胞因子如IL-6等[14]。IL-6量反映肺炎患者的疾病严重程度，Zobel K[15]和Lee YL[16]研究表明，典型的细菌性感染可导致体内IL-6含量提高。Groppo等[17]发现，茶树精油中的主要成分1,8-桉树脑和4-萜烯醇能减轻口腔组织炎症；茶树精油可溶成分可抑制肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素1(IL-1)、IL-10和前列腺素E2等炎症因子诱导脂多糖的产生[18]。本研究发现，小鼠感染金黄色葡萄球菌后血液中白细胞和中性粒细胞升高、IL-6含量增加，小鼠处于肺炎应激状态，但小鼠吸嗅茶树精油3 d后血液中白细胞数下降、IL-6含量降低，茶树精油可能通过降低致炎因子和减少炎性细胞浸润缓解小鼠肺部炎症。

综上所述，茶树精油对体外大肠杆菌、金黄色葡萄球菌有一定抑制作用，小鼠吸嗅茶树精油对金黄色葡萄球菌感染小鼠致肺炎症状有一定的缓解作用，研究提示未来可开发茶树精油作为抗炎药物。