稳消Ⅱ方对实验兔动脉粥样硬化模型PPARγ信号通路的影响

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是世界公认的威胁人类健康的首要致残、致死原因[1]，由此导致的心脑血管意外严重威胁人类生命。近年来的研究逐渐表明动脉粥样硬化的发生发展受一系列炎性因子介导与调控。在抗AS方面，过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ，PPARγ)作为重要的核转录调节因子，参与调节脂质代谢、抑制炎症反应等抗AS环节[2-3]。稳消Ⅱ方是我院霍清萍教授多年来控制AS、稳定斑块的经验方，临床疗效较为满意。本研究通过建立高脂饲料实验兔AS模型，观察稳消Ⅱ方对PPARγ蛋白表达的影响，进一步研究稳消Ⅱ方抗AS的作用机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 新西兰健康大白兔38只，月龄3～4个月，体重1.9～2.3 kg，购自上海车墩实验动物良种厂[生产许可证号：SCXK(沪)2012-0008]，雌雄不限。饲养条件为2级，相对湿度50%，饲养室温控制在20～24 ℃，光照时段06：00～18：00。

1.2 实验用药 高脂饲料(由91%普通食料、1%胆固醇、5%蛋黄粉、3%猪油组成)委托上海中医药大学实验动物中心代为加工。稳消Ⅱ方免煎颗粒(水蛭、地龙、丹皮、丹参、郁金、半夏)及辛伐他汀给药剂量及方法按照课题组前期实验设计[4]，并结合人与动物体质量比例折算[5]后给药。

1.3 主要试剂与仪器 包括PPARγ抗体、PPARγ免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒；离心机、脱色摇床、移液枪、正置荧光显微镜、成像系统等。

1.4 造模与分组 实验兔饲养在上海中医药大学实验动物中心，饲养条件同1.1。称重，用完全随机分组法[6]分为空白组(9只)与造模组(29只)。造模组干预8周后取2只兔腹主-髂总动脉分支处向上1.5～2.0 cm为标本，肉眼观察动脉斑块的颜色、形态、大小，经HE染色后确认造模成功。然后将造模组实验兔随机分为模型组(9只)、对照组(9只)及稳消Ⅱ方组(9只)。实验过程中喂养方式、各组药物剂量及给药方法、干预时间均参照课题组前期实验设计进行[4]。

1.5 观察指标

1.5.1 血脂检测 分别于造模前、造模后、干预后经兔耳缘静脉采血，离心后测定血脂[总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)]指标。

1.5.2 PPARγ检测 干预结束后，全部实验兔予3%戊巴比妥钠肌肉注射麻醉，无菌条件下取腹主-髂总动脉分支处向上1.5～2.0 cm，用0.9%NaCl洗涤后置于4%多聚甲醛固定，免疫组化法测定PPARγ蛋白表达。各组每张切片随机挑选3个视野在200倍光镜下拍照。应用Image-Pro 6.0选取各视野相同棕黄色作为阳性判断标准，测定每张200倍照片的PPARγ阳性细胞的比率及灰度，得出阳性的累积光密度值(IOD)，并计算图片组织的累积光密度值/面积(AREA)，得出IOD/AREA比值。

2 结 果

2.1 一般情况 实验结束时共计33只实验兔(空白组8只、模型组8只、对照组8只、稳消Ⅱ方组9只)，造模期间死于肺炎、腹泻各1只，死因不明1只，随机处死2只。各实验兔于药物干预期间生命体征平稳。

2.2 各组血脂检测结果 造模前空白组与造模组血脂水平相比差异无统计学意义(P>0.05)；造模后，造模组TC、TG、LDL较空白组显著升高(P<0.05)，HDL较空白组显著下降(P<0.05)；对照组、稳消Ⅱ方组、模型组干预前血脂水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；干预后，稳消Ⅱ方组、对照组TC、TG、LDL较模型组显著下降(P<0.05)，HDL水平较模型组显著升高(P<0.05)。稳消Ⅱ方组与对照组血脂水平相比差异无统计学意义(P>0.05)，稳消Ⅱ方组与对照组干预后血脂水平与干预前相比差异有统计学意义(P<0.01)。详见表1、表2。

表1 空白组与造模组造模前后血脂比较(±s) mmol/L

与空白组造模后比较，1)P<0.05

表2 各组干预前后血脂比较(±s) mmol/L

与同组干预前比较，1)P<0.01；与模型组干预后比较，2)P<0.05

2.3 PPARγ免疫组化结果 对PPARγ阳性结果(IOD/AREA)分析如下：与空白组相比，模型组动脉内膜下棕黄色颗粒状阳性染色物质明显减少(P<0.01)；与模型组相比，稳消Ⅱ方组与对照组内膜下阳性染色物质均有显著增加(P<0.05)；稳消Ⅱ方组PPARγ表达水平与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。详见表3、图1。

表3 各组PPARγ蛋白表达水平(±s)

与空白组比较，1)P<0.01；与模型组比较，2)P<0.05

图1PPARγ免疫组化结果(×200)

3 讨 论

近年来越来越多的研究表明，PPARγ信号通路在改善脂质代谢紊乱、稳定粥样斑块过程中发挥着重要作用，是抗AS的重要研究靶点。PPARγ不仅可以通过抑制炎症反应及泡沫细胞的生成起到抗炎作用，还可减少单核细胞及内皮细胞黏附分子的表达，抑制巨噬细胞转化为粥样斑块[7]，有助于稳定斑块。被配体激活的PPARγ可减少多种炎症因子包括血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)、细胞间黏附分子(intercellularadhesion molecular-1，ICAM-1)、基质金属蛋白酶(matrix metalloprotease，MMP)和E-选择素的蛋白表达，抑制动脉血管中层平滑肌细胞增生迁移至内膜[8-10]。PPARγ通过调节下游多个靶点拮抗氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)摄入，促使细胞内胆固醇外流，减少脂质聚积[11]，从而增加斑块的稳定性、延缓AS进展。

传统中医学理论认为AS的发生发展涉及多种因素，如年老体衰、六淫侵袭、情志失调、饮食劳倦，或由其他病因导致的脏腑气血功能失调等。湿、热、痰、瘀、虚及毒邪等多种致病因素相互夹杂、相互转化，损伤脉道，病性多本虚标实。在临床诊疗过程中本病病人多有口干口苦、大便粘滞、舌红苔黄腻、脉弦数等痰湿瘀阻、蕴而化热之象。痰浊聚积、瘀热互结在AS发病过程中始终存在，日久毒热凝集，易造成斑块增生脱落，增加心脑血管系统意外的风险。稳消Ⅱ方是霍清萍教授常用的抗AS经验方，该方中以水蛭为君药破血逐瘀消癥，地龙性走窜，为臣药，具有搜风通络、活血化瘀之功效，既助君药祛风活血、化瘀通络，亦能平肝止痉、清热熄风，佐以丹参、丹皮凉血活血、清热解毒化瘀；半夏化痰、燥湿、散结；郁金行气活血、凉血解郁，既助水蛭清热活血，又加强半夏化痰行气。全方药简力专，以达活血化瘀清热、行气化痰通络之效。

课题组前期研究证实稳消Ⅱ方在改善血脂代谢紊乱[12-13]的同时，可抑制ICVM-1、VCAM-1、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)、C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)等炎症指标及纤维蛋白原(fibrinogen，FIB)升高[14-16]，抑制核转录因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)P65蛋白的表达[4]，其调脂、抗炎、稳定斑块作用明确，对肝肾功能无不良影响。

本实验结果显示，稳消Ⅱ方可显著降低总胆固醇、三酰甘油及低密度脂蛋白水平，升高高密度脂蛋白，与课题组既往研究结果相符[12-13]。稳消Ⅱ方可通过激活PPARγ转录通道，上调PPARγ蛋白表达水平，从而调节脂质代谢、抑制多种炎症因子表达，增加斑块稳定性。稳消Ⅱ方组、对照组PPARγ蛋白表达水平与模型组相比均明显上升(P<0.05)，提示稳消Ⅱ方与辛伐他汀均可上调PPARγ蛋白表达水平，稳消Ⅱ方上调PPARγ水平与辛伐他汀相近。本实验不足之处在于样本量偏少，有待于后续大样本实验加以进一步论证。