铁皮枫斗颗粒对糖尿病大鼠肾脏的保护作用

常景芝， 蒋建平， 李宜川， 刘国玲， 郭 辉， 刘 青， 芦 琨， 刘 嘉，关红亚

（1. 商丘医学高等专科学校基础医学部， 河南 商丘 476100； 2. 郑州大学附属郑州中心医院， 河南 郑州 450000）

糖尿病肾病是糖尿病引起的微血管并发症之一， 危害性大， 致死率高， 糖尿病肾病肾小球系膜细胞膜上葡萄糖转运蛋白-1 （GLUT-1） 的高度表达被认为是其重要发病机制[1］。 研究表明， 高糖可通过激活p38 丝裂原活化蛋白激酶（P38 MAPK）， 促进系膜细胞增殖， 从而增加下游结缔组织生长因子（CTGF） 合成[2-4］， 后者可促进成纤维细胞增生， 与许多组织器官的纤维化发生发展密切相关[5］。 铁皮枫斗Dendrobium candicum Wall. ex Lindl. 为铁皮石斛加工后的干品， 其主要成分为石斛多糖、 石斛碱、 总氨基酸等， 具有益胃生津、 滋阴清热等药理作用[6］。 本实验拟通过建立糖尿病大鼠模型， 探讨铁皮枫斗颗粒对其肾脏的保护作用及机制。

1 材料

1.1 药物 铁皮枫斗颗粒购自浙江天皇药业有限公司， 批号1501063； 厄贝沙坦购自赛诺菲（杭州） 制药有限公司，批号1411027。

1.2 动物 健康雄性大鼠70 只， 体质量200～220 g， 购自山西医科大学动物实验中心， 动物生产许可证号SCXK（晋） 20150001。

1.3 试剂 链脲佐菌素 （批号SLBB7534V） 购自美国Sigma 公 司； 血 肌 酐 （批 号1310024）、 尿 素 氮 （批 号14021217）、 血 糖 （ 批 号 1407049）、 尿 蛋 白 （ 批 号1408067） 检测试剂盒购自中生北控生物科技股份有限公司； 血管内皮生长因子ELISA 检测试剂盒（批号1403045）购自武汉博士德生物技术有限公司； GLUT-1 （批号SP0023）、 CTGF （批号SP0022） 免疫组化试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司； 兔抗GLUT-1 （批号BS0472R）、兔抗CTGF （批号BS0472R） 购自英国Abcam 公司； 逆转录 试 剂 盒 （ 批 号 00264978）、 PCR 试 剂 盒 （ 批 号00392278） 购自美国Thermo Scientific 公司； PCR 引物（批号HB1411099005） 购自上海生工生物工程有限公司。

1.4 仪器 日立7600 型全自动生化分析仪（日本日立公司）； 罗氏Accu-Chek 血糖测定仪（瑞士罗氏公司）； Bio-Rad 500 型酶标仪（美国Bio-Rad 公司）； ABI 7500 型实时荧光定量PCR 仪（美国ABI 公司）。

2 方法

2.1 建模及分组 大鼠随机分为正常组（12 只） 和造模组（70 只）， 造模组大鼠腹腔注射l%链脲佐菌素（60 mg／kg），对照组大鼠腹腔注射等体积枸橼酸缓冲液（0.1 mol／L），72 h 后尾静脉采血， 测定血糖浓度， ≥16.7 mmol／L 时为建模成功。 造模组大鼠随机分为模型组、 厄贝沙坦组（17.5 mg／kg）、 铁皮枫斗颗粒组， 其中最后一组根据临床每天服用剂量和文献[7］ 又分为低剂量（0.2 g／kg）、 中剂量（0.4 g／kg）、 高剂量（0.8 g／kg）， 给药组大鼠每天灌胃1 次， 连续8 周， 正常组、 模型组大鼠给予等体积生理盐水。

2.2 标本收集 在第4、 8 周， 称定大鼠体质量， 尾静脉采血， 测定血糖浓度， 并收集24 h 尿液用于测定24 h 尿蛋白； 在第8 周末， 腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠后静脉取血，分离血清， -20 ℃下保存， 用于测定血肌酐、 尿素氮。 取大鼠双肾， 充分灌洗后称定质量， 右肾取一部分肾皮质，固定于4%聚甲醛中， 剩余部分置于液氮中保存待用。

2.3 生化指标检测 血糖仪测定血糖， 自动生化分析仪测定血肌酐、 尿素氮、 24 h 尿蛋白， 双抗体夹心ELISA 法测定血管内皮生长因子。 肾质量指数=右肾质量／体质量。

2.4 大鼠肾皮质GLUT-1、 CTGF 表达检测 免疫组化采用SP 法。 按照标准步骤， 分别加入GLUT1 一抗（1 ∶200）、CTGF 一抗（1 ∶100） 孵育， 再加入二抗， 显色并复染，设置阳性、 阴性对照。 高倍显微镜下（×400） 每张切片随机选取5 个不同的视野， 测定光密度值， 取平均值。

2.5 肾脏病理学检测 取石蜡包埋的大鼠肾皮质， 按照标准步骤切片， 常规HE 染色， 光学显微镜下观察其病理形态学变化。

2.6 大鼠肾皮质GLUT-1、 CTGF 蛋白表达检测 采用Western blot 法。 取肾组织裂解， 匀浆， 测定上清蛋白浓度， 6% SDS-PAGE 电泳、 转膜、 封闭后， 分别加入GLUT-1 一抗、 CTGF 一抗， 4 ℃下孵育过夜， 洗涤液（TBST） 洗涤3 次后， 加入用HRP 标记的二抗， 室温下封闭2 h， 再加入TBST 洗涤3 次， 每次10 min， 按照蛋白检测说明书，采用ECL 发光法检测蛋白。

2.7 大鼠肾皮质GLUT-1、 CTGF mRNA 表达检测 采用RT-PCR 法。 Trizol 法抽取总RNA 后， 逆转录试剂盒将总RNA 逆转录为cDNA， 在实时荧光定量PCR 仪上进行定量分析。 以GAPDH 为 内 参， GLUT-1 正 向5′-TCTGGCATCAACGCTGTCTTC-3′， 反向5′-CGATACCGGAGCCAATGGT-3′； CTGF 正向5′-TAGCTGCCTACCGACTGGAA-3′， 反向5′-CTAGAACAGGCGCTCCACT-3′； GAPDH 正 向5′-GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG-3′， 反 向 5′-GAGCCCCAGCCTTCTCCATG-3′， 反应条件为95 ℃预变性5 min， 95 ℃15 s，60 ℃退火30 s， 40 个循环， 72 ℃终末延伸5 min。 再应用2-△△Ct法对结果进行分析。

2.8 统计学分析 通过SPSS 19.0 软件进行处理， 作图选择GraphPad Prism 软件， 计量数据以表示， 非正态分布数据经对数转换后进行分析， 2 组间比较采用t 检验， 多组间比较采用单因素方差分析。 P＜0.05 表示有显著性差异。

3 结果

3.1 常规指标 表1 显示， 在第4、 8 周， 模型组、 铁皮枫斗颗粒组、 厄贝沙坦组大鼠血糖浓度显著高于正常组（P＜0.01）， 但各组之间无显著差异（P＞0.05）。 模型组大鼠体质量显著低于正常组（P＜0.01）， 而铁皮枫斗颗粒组（第8 周低剂量组除外）、 厄贝沙坦组显著高于模型组（P＜0.05）。 与正常组比较， 模型组大鼠肾重指数显著增加（P＜0.01）； 与模型组比较， 铁皮枫斗颗粒组、 厄贝沙坦组大鼠肾重指数显著降低（P＜0.01）。

表1 各组大鼠常规指标比较

表1 各组大鼠常规指标比较

注：与正常组比较，##P＜0.01；与模型组比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01

正常组 12 — 6.43±0.65 6.39±0.61 362.29±12.90 451.79±21.05 3.82±0.42模型组 12 — 23.34±1.77## 27.56±2.09## 315.30±6.80## 305.35±8.55## 10.24±1.03##铁皮枫斗颗粒低剂量组 11 0.2 22.74±1.59## 27.34±2.31## 321.10±7.14∗ 312.08±9.19 7.52±0.69∗∗铁皮枫斗颗粒中剂量组 12 0.4 22.48±1.55## 26.79±2.27## 322.41±8.04∗ 313.25±8.54∗ 6.32±0.54∗∗铁皮枫斗颗粒高剂量组 12 0.8 22.25±1.55## 26.63±2.45## 324.15±9.23∗ 316.15±9.23∗ 5.97±0.48∗∗厄贝沙坦组 11 17.5 mg／kg 22.85±1.69## 26.94±2.17## 322.82±8.13∗ 314.33±8.87∗ 6.04±0.52∗∗

3.2 生化指标 表2、 图1 显示， 与正常组比较， 模型组、铁皮枫斗颗粒组、 厄贝沙坦组大鼠血肌酐、 尿素氮、 24 h尿蛋白、 血管内皮生长因子显著升高（P＜0.01）； 与模型组比较， 铁皮枫斗颗粒组、 厄贝沙坦组上述生化指标显著下降（P＜0.05， P＜0.01）， 其中铁皮枫斗颗粒组呈剂量依赖性。

表2 各组大鼠生化指标比较（

表2 各组大鼠生化指标比较（

注：与正常组比较，##P＜0.01；与模型组比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01

组别 动物数／只剂量／（g·kg-1）血肌酐／（μmol·L-1）尿素氮／（mmol·L-1）24 h 尿蛋白／（mg·d-1）血管内皮生长因子／（μg·L-1）正常组 12 — 42.77±5.62 7.41±0.76 7.56±0.81 27.05±4.52模型组 12 — 79.63±4.25## 13.84±1.19## 26.29±6.53## 89.54±10.27##铁皮枫斗颗粒低剂量组 11 0.2 72.17±8.25∗ 12.79±0.94∗ 18.28±2.60∗∗ 65.34±7.52∗∗铁皮枫斗颗粒中剂量组 12 0.4 69.73±7.75∗ 12.13±0.87∗ 17.16±2.56∗∗ 62.14±6.94∗∗铁皮枫斗颗粒高剂量组 12 0.8 65.79±6.36∗ 11.62±1.12∗∗ 16.20±3.25∗∗ 58.41±6.87∗∗厄贝沙坦组 11 1.75×10-4 68.85±7.34∗ 11.79±0.92∗ 16.91±2.72∗∗ 60.23±7.02∗∗

3.3 肾脏病理变化 图2 显示， 正常组大鼠肾小球结构无明显病理变化； 模型组大鼠肾脏有病理变化， 表现为肾小球肥大、 系膜结构改变； 铁皮枫斗颗粒组、 厄贝沙坦组上述现象明显减轻， 其中铁皮枫斗颗粒组呈剂量依赖性。

3.4 大鼠肾皮质GLUT-1、 CTGF 表达 图3～5 显示， 与正常组比较， 模型组大鼠肾组织着色广泛、 浓集， GLUT-1、CTGF 表达显著增高（P＜0.01）； 与模型组比较， 铁皮枫斗颗粒组、 厄贝沙坦组大鼠肾组织着色范围相似， 但程度明显减轻， GLUT-1、 CTGF 表达显著下降（P＜0.01）， 其中铁皮枫斗颗粒组呈剂量依赖性。

图1 不同剂量铁皮枫斗颗粒对大鼠血肌酐（A）、 尿素氮（B）、 24 h 尿蛋白（C）、 血管内皮生长因子（D） 的影响

图2 各组大鼠肾脏病理变化（×400）

图3 各组大鼠肾皮质GLUT-1 表达（×400）

3.5 大鼠肾皮质GLUT-1、 CTGF 蛋白表达 图6 显示， 与正常组比较， 模型组GLUT-1、 CTGF 蛋白表达显著升高（P＜0.01）； 与模型组比较， 铁皮枫斗颗粒组、 厄贝沙坦组两者表达显著降低（P＜0.01）。

图4 各组大鼠肾皮质CTGF 表达（×400）

图5 各组大鼠肾皮质GLUT-1 （A）、 CTGF （B） 表达

3.6 大鼠肾皮质组织GLUT-1、 CTGF mRNA 的表达 图7显示， 与正常组比较， 模型组GLUT-1、 CTGF mRNA 表达显著升高（P＜0.01）； 与模型组比较， 铁皮枫斗颗粒组、厄贝沙坦组两者表达显著降低（P＜0.05， P＜0.01）。

图6 各组大鼠肾皮质GLUT-1 （A）、 CTGF （B） 蛋白表达

4 讨论

高糖环境可导致组织局部缺氧， 缺氧诱导因子-1（HIF-1） 表达增加， 进而导致VEGF 表达上调， 被认为是糖尿病肾病的发病机制之一[8］。 本实验发现， 铁皮枫斗颗粒能显著降低大鼠血清中VEGF 表达， 并呈剂量依赖性。前期报道， 铁皮枫斗具有耐缺氧活性， 对糖尿病血管病变具有一定保护作用[9］； 本实验结果提示， 铁皮枫斗颗粒可能通过提高缺氧耐受来降低HIF-1 表达， 干扰大鼠体内VEGF 表达， 从而延缓糖尿病肾病进程， 发挥保护肾脏的作用。

葡萄糖转运蛋白是调控细胞内糖摄入及糖代谢的第一道关卡， 在介导糖尿病组织损伤中起着重要作用。 GLUT-1是GLUT 最主要的亚型， 其高表达可提高肾小球对葡萄糖的吸收， 增加糖尿病肾病风险。 受到各种胞外信号刺激后，P38 MAPK 信号转导通路是细胞内信号传递的共同通路[4，10］， 而高糖可通过激活P38 MAPK 来增加下游转化生长因子TGF-β 合成， 并且CTGF 在TGF-β 致纤维化过程中也发挥着重要作用[11］。 前期研究显示， 肾小球、 肾小管、肾间质纤维化在糖尿病肾病发生发展中起到了重要作用[12］； 本实验通过免疫组化、 Western blot、 RT-PCR 法检测大鼠肾皮质中GLUT-1、 CTGF 蛋白、 mRNA 表达， 发现与模型组比较， 铁皮枫斗颗粒组其表达量显著降低， 并呈剂量依赖性。 由此可知， 铁皮枫斗颗粒能有效减少GLUT-1表达， 尽管对大鼠血糖浓度无明显影响， 但对糖尿病肾病进展具有抑制作用， 它对GLUT-1 表达的影响及耐缺氧活性可减少胞外信号刺激， 干扰P38 MAPK-CTGF 通路激活，从而减少下游TGF-β、 CTGF 表达。

图7 各组大鼠肾皮质GLUT-1 （A）、 CTGF （B）mRNA 表达

铁皮枫斗颗粒治疗8 周后， 肾重指数、 血肌酐、 尿素氮、 24 h 尿蛋白等肾功能相关指标明显改善。 同时， 肾脏病理组织学检查发现该制剂能有效延缓大鼠肾病进展， 并呈剂量依赖性。

综上所述， 铁皮枫斗颗粒对糖尿病大鼠肾脏有保护作用， 其机制可能与调节VEGF、 GLUT-1、 CTGF 表达来延缓糖尿病肾病进展有关。