3 个品种金银花不同器官中3 种有效成分的比较

何 平， 郭晔红， 李 欠， 吴继宇

（甘肃农业大学农学院， 中草药栽培与鉴定系／中药材研究所， 甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室， 甘肃省中药材规范化生产技术创新重点实验室， 甘肃省药用植物栽培育种工程研究中心， 甘肃省干旱生境作物学重点实验室， 甘肃 兰州 730070）

忍冬科、 忍冬属植物忍冬Lonicera japonica Thunb. 的干燥花蕾（金银花， 又名忍冬） 和茎枝（忍冬藤） 均可入药， 两者具有清热解毒的功效[1］， 主产于山东、 河南， 全国大部地区均有栽培。 国内外研究人员对金银花的化学成分及药理作用作了大量研究， 结果表明其中富含挥发油、 有机酸、 黄酮、 环烯醚萜类等， 广泛应用于治疗各种疾病， 包括发烧、 感染、 肿胀等[2-3］。 另外， 金银花提取物具有广泛的生物活性， 如抗菌、 抗炎、 解热、 抗病毒、 抗氧化等作用[4-6］。

现代医学研究发现， 在不同品种的金银花中均可检测到花青素[7］， 它属类黄酮化合物， 为普遍存在于植物中的水溶性天然色素， 是花、 茎和叶颜色的主要呈色物质， 同时也是具有较高抗氧化能力的次级代谢物[8］， 因其抗氧化、 抗炎和抗肿瘤等作用而被广泛研究[9-10］。

忍冬叶作为非药用部分， 长期以来未得到充分利用， 导致大量资源浪费。 研究表明， 忍冬叶中有机酸、 黄酮等成分均具有良好的抗氧化作用， 其中叶片中黄酮含有量明显高于花蕾和茎枝中[11-13］。目前对金银花中花青素的研究较为集中， 但对其茎枝、 叶片中该成分的检测还未见报道， 故本实验采用HPLC 法检测“亚特红” “亚特青蕾” 金银花和忍冬3 个地上器官中绿原酸、 木犀草苷、 花青素的含有量， 为扩大西北地区忍冬属植物资源， 改善西北地区生态环境， 有效利用金银花叶片提供理论依据。

1 材料

日立L-2000 型高效液相色谱仪（天美科技有限公司）； AL104 型电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海） 有限公司］； 万能粉碎机（浙江屹立工贸有限公司）； 循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）； LT-250 型超声波药品处理机（济宁鲁通超声电子设备有限公司）； 优普系列超纯水器（四川优普超纯科技有限公司）。

乙腈、 甲醇、 磷酸均为色谱纯； 盐酸、 甲醇均为分析纯； 超纯水过滤。 对照品绿原酸 （批号GR133151019， 南京广润生物制品公司）； 木犀草苷（GR133151228， 南京广润生物制品公司）； 矢车菊-3-O-葡萄糖苷（批号LB30Q125， 北京百灵威公司）。 因矢车菊-3-O-葡萄糖苷是较为常见的花青素[14］， 故本实验选用其作为对照。

“亚特红” 金银花Lonicera japonica Yatehong LSB 用YTH 表示， 良种编号国S-SV-LJ-023-2010鲁S-SV-LJ-002-2004； “亚特青蕾” 金银花Lonicera japonica Yateqinglei LSB 用QL 表示， 良种编号鲁SSV-LJ-003-2004[15］； 以忍冬Lonicera japonica Thunb.作对照， 用cK 表示， 具体见表1。 “亚特” 金银花品种购自山东亚特生态技术有限公司， 忍冬由甘肃农业大学郭晔红副教授鉴定为正品。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2 方法与结果

2.1 色谱条件 绿原酸、 木犀草苷分析采用LaChrom C18色谱柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）； 流动相乙腈（A） -0.1% 磷酸（B）， 梯度洗脱（0 ～5 min， 86% B； 5 ～15 min， 86% ～72% B； 15 ～27 min， 72% ～75%B； 27～30 min， 75% ～86%B）；体积流量1.0 mL／min； 柱温30 ℃； 检测波长绿原酸327 nm、 木犀草苷350 nm。

矢车菊-3-O-葡萄糖苷分析采用LaChrom C18色谱柱 （4.6 mm×250 mm， 5 μm）； 流动相乙腈（A） -0.1% 磷酸 （B）， 梯度洗脱 （0 min， 10%A； 25 min， 25% A； 25.1 min， 10% A； 30 min，10% A[16］）； 体积流量1.0 mL／min； 柱温40 ℃；检测波长525 nm； 进样体积20 μL。

2.2 对照品溶液制备 精密称取对照品绿原酸、木犀草苷10 mg 和矢车菊-3-O-葡萄糖苷5 mg， 绿原酸与木犀草苷用50% 甲醇溶液溶解并定容至10 mL， 矢车菊-3-O-葡萄糖苷用5% HCL-甲醇溶解并定容至10 mL， 充分摇匀， 配制成1.05、 1.03、0.50 mg／mL， 即得， 4 ℃保存备用。

2.3 供试品溶液制备 将“亚特红” “亚特青蕾”金银花和忍冬的花、 叶、 茎枝干燥后， 用万能粉碎机粉碎（过4 号筛）， 精密称取1.0、 0.1 g， 分别用50% 甲醇、 10 mL 5% HCl-甲醇溶液浸泡10 h，25 ℃超声30 min， 补足至25、 10 mL， 提取液用0.22 μm 滤膜过滤到1.5 mL 棕色小瓶中， 即得。

2.4 线性关系考察 见表2。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度试验 取“2.2” 项下花青素对照品溶液， 在“2.2” 项色谱条件下连续进样6 次， 每次20 μL， 测得花青素的峰面积RSD 2.18%， 表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 取同1 样品提取液， 将样品放置0、 2、 4、 6、 8、 10 h 后， 在“2.2” 项色谱条件下进样， 测得绿原酸、 木犀草苷、 矢车菊-3-O-葡萄糖苷保留时间RSD 分别为0.59%、 0.26%、1.94%， 表明供试品溶液在10 h内稳定性良好。

2.7 加样回收率试验 向含有量已知的供试品中添加花青素对照品溶液， 分别按样品溶液中已知含有量的80%、 100%、 120% 加入， 作为3 个水平，每个水平重复3 次， 在“2.2” 项色谱条件下进样， 计算回收率。 结果， 花青素平均加样回收率为100.49%。

2.8 样品含有量测定 取不同品种、 器官样品，按“2.3” 项下方法制备供试品溶液， 在“2.2”项色谱条件下进样， 色谱图见图1。

3 分析与讨论

3.1 绿原酸含有量差异 图2 表明， 3 个品种金银花中绿原酸成分含有量分布规律为第1 茬花＞茎枝＞第2 茬花＞叶片， 品种之间含有量比较规律为“亚特红” 金银花＞ “亚特青蕾” 金银花＞忍冬。绿原酸是2015 版《中国药典》 中规定的指标成分， 在金银花干燥品中含有量不得低于1.50%，经测定， 花中其含有量平均值全部高于2.50%，符合入药标准。 另外， 各品种中第2 茬金银花的含有量均低于第1 茬， 忍冬、 “亚特红” 和“亚特青蕾” 的第1 茬金银花分别是第2 茬的1.33、 1.40、1.28 倍， 表明第1 茬（5 月采收） 质量较好。 各品种金银花茎枝中绿原酸平均含有量分别为2.63%、 3.79%、 3.00%， 叶片中分别为1.43%、2.34%、 1.70%， 表明除忍冬叶片略低外， 其他样品均高于《中国药典》 标准。

图2 3 个品种金银花不同器官绿原酸含有量Fig.2 Chlorogenic acid content in different organs of three cultivars of L． japonica

3.2 木犀草苷含有量差异 2015 版《中国药典》中规定金银花中木犀草苷按干燥品计算含有量不得少于0.050%。 图3 表明， 忍冬和“亚特青蕾” 金银花中木犀草苷含有量分布为茎枝＞叶片＞第1 茬花＞第2 茬花， “亚特红” 金银花中为叶片＞茎枝＞第1 茬花＞第2 茬花； 各品种间为“亚特红” ＞“亚特青蕾” ＞忍冬， 而且3 个地上器官中其含有量均高于《中国药典》 要求， 符合入药标准。 其中， 忍冬、 “亚特红” 金银花、 “亚特青蕾” 金银花的叶片含有量分别是第1 茬花的1.40、 2.87、2.10 倍， 茎 枝 分 别 是 第1 茬 花 的1.30、 1.76、2.56 倍， 表明叶片中含有较多的木犀草苷。

图3 3 个品种金银花不同器官木犀草苷含有量Fig.3 Luteoloside content in different organs of three cultivars of L． japonica

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

3.3 花青素含有量差异 图4 表明， 3 个品种金银花中花青素含有量分布规律均为叶片＞茎枝＞第1茬花＞第2 茬花； 在同一器官中， 3 个品种中为“亚特红” 金银花＞忍冬＞ “亚特青蕾” 金银花。在3 个品种中， “亚特红” 金银花中花青素含有量最高， 与忍冬和“亚特青蕾” 金银花的含有量差异达极显著水平（P＜0.01）， 第1 茬、 第2 茬、 茎枝、 叶 片 含 有 量 依 次 为 0.69、 0.57、 0.80、1.79 mg／g， 叶片含有量是第1 茬花的2.59 倍、 第2 茬花的3.14 倍、 茎枝的2.24 倍， 叶片与第1、 2茬花、 茎枝差异极显著（P＜0.01）。 “亚特青蕾”金银花中含有量最低， 与忍冬含有量差异不大， 表明在“亚特青蕾” 金银花与忍冬的不同地上器官中含极少量的花青素。 “亚特青蕾” 金银花与忍冬的3 个地上器官呈绿色或青绿色， 而“亚特红”金银花花蕾与新嫩茎枝呈紫红色， 叶片正面呈深绿色， 叶背呈明显的紫红色， 也可判断出“亚特红”金银花中花青素含有量最高。

图4 3 种金银花不同器官花青素含有量Fig.4 Anthocyanin content in different organs of three cultivars of L． japonica

3.4 有效成分比例 表3 表明， 3 个品种金银花不同地上器官之间有效成分含有量差异较大， 在忍冬中， 绿原酸与木犀草苷比例在第2 茬花中最高，达41.00 ∶1， 叶片最低， 为10.21 ∶1； 绿原酸与花青素比例第2 茬花最多， 达351.43 ∶1， 同样也是叶片比例最低， 为40.86 ∶1。 在“亚特红” 金银花中， 绿原酸与木犀草苷比例与忍冬一致， 第2茬花中最高， 达35.43 ∶1， 叶片最低， 为8.85 ∶1；绿原酸与花青素比例规律也与忍冬相同， 第1 茬花中最多， 叶片中最少。 在“亚特青蕾” 金银花中，绿原酸与木犀草苷、 绿原酸与花青素比例规律与前2 个品种一致。 在3 个品种金银花中， 3 种成分的比例规律均为第2 茬花＞第1 茬花＞茎枝＞叶片。

表3 3 个品种金银花不同器官有效成分比例Tab.3 Proportions of active ingredients in different organs of three cultivars of L． japonica

4 讨论

目前《中国药典》 规定， 金银花入药部位包括花及茎枝， 入药后分别为金银花和忍冬藤， 有研究强调， 金银花植株不同器官中均含不同程度的药效成分[17］。 通过对第1、 2 茬花、 茎枝和叶片中绿原酸、 木犀草苷、 花青素含有量的测定发现， 第1茬花3 种成分含有量均高于第2 茬花， 其原因是第1 茬花成花前处于缓苗阶段， 并且在5 月份阳光充足， 温度适宜， 有利于花枝分化生长， 同化物供应充分， 促使各种有效成分含有量积累较多。 在第1茬花采收后， 植物开始缓茬， 处于生理休眠期， 在6 至7 月温度升高， 植株中各种营养供应在植物纵向生长上， 不利于花枝的分化， 则第1 茬高于第2茬。 木犀草苷与花青素含有量测定结果显示， 3 个品种金银花叶片含有量均高于花， 与武雪芬等[18］报道金银花总黄酮含有量叶＞花蕾相吻合。 在忍冬与“亚特青蕾” 金银花绿原酸和木犀草苷含有量测定结果中， 茎枝高于叶片， 与前人研究结果相似， 由于茎枝与叶片采收时间处于全年生长后期，次生代谢物质由叶片向茎枝运输， 因此该部位中含有量高于叶片中。 在花青素含有量测定中， “亚特红” 金银花因其外观呈紫红色， 故远高于另外2个品种。

5 结论

在3 个地上器官中， 叶片中木犀草苷与花青素积累量均高于花， 但绿原酸含有量较低， 因此可认为叶片具有一定的药用价值。 另外， 忍冬叶片有过冬不落的特点， 且不受物候期限制， 易获得， 可大大降低成分提取来源成本。 “亚特红” 金银花属良种， 耐旱、 抗病虫害能力强， 常用于绿化、 观赏。本实验证实， 在绿原酸、 木犀草苷、 花青素含有量测定中， 西北地区种植的“亚特红” 金银花和忍冬达到《中国药典》 要求， 其中前者有效成分含有量较高， 具有更大的药用价值， 另外叶片也具有一定的再利用价值， 可为西北地区推广种植良种金银花提供参考依据， 并为扩大该品种资源， 改善西北生态环境作出贡献。