临床梅毒螺旋体菌株兔感染模型构建

张 园 任 卓 侯建玲 郑荣涛 李中伟刘建新 庞 静 黄 娜 田洪青1,

梅毒是由梅毒螺旋体(Treponemapallidum，Tp)感染所致的一种性传播疾病，危害极大，可侵犯全身各组织器官或通过胎盘传播引起死产、流产、早产和胎传梅毒。据国家卫生和计划生育委员会发布数据，近十年来梅毒居乙类传染病发病数前3位，梅毒受到广泛关注。梅毒螺旋体长期以来无法成功连续体外培养，很大程度上限制了对梅毒的研究。虽然目前有关于梅毒螺旋体长期体外培养的文章报道[1]，但是过程复杂。另一方面，通过对梅毒螺旋体全基因组测序发现不同地域不同菌株之间存在一定差异，此差异是否影响发病机制尚未清楚[2]。同时，梅毒研究多基于临床Nichols标准株[3,4]，由于地域差别，对标准株的研究远远不能满足对当地梅毒的认知。因此，建立并研究当地梅毒螺旋体临床菌株感染动物模型具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 新西兰雄兔购于济南西岭角养殖繁育中心，体重2.5～3.5 kg，年龄4个月左右，取血清行梅毒螺旋体颗粒凝集试验(TPPA)、梅毒甲苯胺红不加热血清血清试验(TRUST)检测以排除兔梅毒螺旋体感染，预先饲养1周使其适应环境，并予不含有抗生素的饲料、水喂养。

1.1.2 菌株 采自山东省皮肤病医院门诊疑似或确诊梅毒的患者。取其皮损分泌物，共收集6例菌株。询问病史，患者自述发病前均有不洁性交史，发病前后无抗生素服用史。其中，患者A、D的TRUST滴度较高，而Tp-PCR阴性，可能原因为临床标本Tp含量低，或Tp-PCR实验过程中Tp-DNA提取不充分。患者F已在外院确诊梅毒，拒绝行Tp-PCR检测。基本临床信息见表1。本研究通过伦理委员会批准，患者签署知情同意书。

表1 患者基本临床信息

注：“-”为阴性，“N”未行Tp-PCR检测

1.1.3 试剂 戊巴比妥钠(山东省实验动物中心惠赠)，0.9%生理盐水，正常兔血清(NRS)(自制)，梅毒螺旋体抗体检测(TPPA)试剂盒(凝集法)(FUJIREBIO INC)，梅毒甲苯胺红不加热血清试验(TRUST)诊断试剂(上海荣盛生物药业有限公司)，梅毒螺旋体(Tp)核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒(广州达安基因生物科技有限公司)。

1.1.4 仪器及相关器材 2mL及5mL注射器，漩涡混合器，兔固定箱，解剖台，实时荧光定量PCR仪ABI7500/7300，生物安全柜，两套无菌手术刀、手术剪、组织镊、止血钳，培养皿，酒精棉球，离心管，离心机，冻存管。

1.2 方法

1.2.1 临床菌株分离 患者充分暴露皮损，无菌棉签清洁梅毒患者皮损，拭子棉签刮取皮损渗液。每位患者取三个拭子，一个用于Tp-PCR检测，另两个用于兔睾丸接种。

1.2.2 菌悬液制备 分别向两个拭子管内加入800 μL 0.9%生理盐水，室温震荡3 min，洗脱拭子棉签中梅毒螺旋体，将含菌生理盐水转入1.5 mL无菌离心管中，加入200 μL NRS，制备为20%NRS菌悬液，4℃保存。

1.2.3 接种 将新西兰兔置于兔盒中，按30 mg/kg 3%戊巴比妥钠行耳缘静脉注射麻醉，待充分麻醉，将其固定于实验动物操作台。按压下腹部充分暴露兔睾丸，消毒睾丸及其周围皮肤，先后取两只注射器各吸取1～1.2 mL菌悬液分别注入两侧睾丸内。接种过程中固定睾丸以防回缩，注射器针头应插入睾丸中间位置，防止菌悬液注入阴囊内。当接种冻存的菌株时，需解冻至室温，以免冻伤兔睾丸。

1.2.4 传代 待兔血清学检测TPPA阳性，兔睾丸出现肿胀变硬时，90 mg/kg 3%戊巴比妥钠静脉注射处死感染梅毒模型兔，将两侧睾丸分离置于无菌培养皿中，快速转移至无菌安全柜内。无菌手术刀及手术剪将睾丸切碎，移入无菌离心管内。向离心管中加入10 mL 50% NRS(NRS与0.9%生理盐水混合)。震荡10 min，300×g水平离心7 min。吸取菌悬液置于无菌离心管，再接种。实验操作过程应严格遵循无菌操作，符合动物实验伦理，实验人员做好自我防护。

1.2.5 保存 取2 mL无菌冻存管，加入1 mL 50% NRS菌悬液，再加入1 mL 100%无菌甘油，将菌悬液与甘油轻轻吹打混匀，置于-80℃冷冻保存备用。

1.2.6 计数 吸取50 μL菌悬液，按照梅毒螺旋体(Tp)核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒说明书操作，对菌悬液进行定性定量分析。

1.2.7 临床观察与血清学检测 接种第3天后，每隔3天观察、触诊睾丸变化。每隔7天抽血检测TPPA、TRUST。

2 结果

2.1 原代兔梅毒模型 采集6株临床梅毒螺旋体，接种成功5株，即A、C、D、E、F株。B株兔模型于接种后因缺氧第2天死亡，可能由于麻醉期间误吸所致。A、 C、D、E、F菌株分别于接种后第28天、7天、14天、32天、35天TPPA转阳，A菌株梅毒兔模型一侧睾丸肿大(图1)，C、D菌株梅毒兔模型双侧睾丸均发现肿大，D菌株兔模型一侧阴囊出现溃疡(图2)。A、C、D菌株分别于接种后第49天、88天、105天处死感染兔，切除睾丸，制备菌悬液，取50 μL菌悬液行PCR荧光检测，A、C、D分别计数为8.87×106、1.03×105、1.03×103，结果汇总见表2。

2.2 传代兔梅毒模型 对A菌株传代，兔于接种后平均6天出现睾丸肿胀，血清学TPPA转阳平均时间为接种后7.7天，睾丸平均分离时间为接种后13.3天，取第一、二、三代50 μL菌悬液行PCR荧光检测计数分别为2.63×106、1.22×104、5.38×104，见表3。三代感染兔均出现睾丸肿胀，未发现淋巴结肿大、眼损伤等临床症状。

图1 A菌株兔模型左侧睾丸肿大

图2 D菌株兔双侧睾丸肿大，左侧阴囊见一溃疡损害

菌接种时间TPPA转阳时间(d)分离时间(d)Tp-PCRA201803012849天8.87×106C20180813788天1.03×105D2018082714105天1.03×103E2018120732--F2019012135--

注:未对E、F菌株分离

表3 A菌株原代与传代梅毒兔模型睾丸炎

注：*为弱阳性

2.3 冷冻菌株兔梅毒模型 第二代菌株冻存55天后接种于兔睾丸，第12天出现睾丸肿胀，第14天TPPA阳性，第39天TRUST阳性，滴度为1∶4。

3 讨论

梅毒螺旋体体外培养困难，建立合适的动物模型是研究梅毒的重要方法。研究发现，Tp可在猿猴、白鼠、仓鼠、豚鼠、家兔体内繁殖[5]。经过大量实验表明，家兔是最理想的梅毒研究动物模型，现已用于明确接种后各阶段梅毒兔的病理生理及相关影响因素的变化，对梅毒发病机制、诊断方法、药物治疗及预后等多方面重要意义[6]。

梅毒感染模型建立受众多因素影响，主要包括菌株因素、宿主因素、实验条件因素及实验方法因素。首先为菌株因素，其包括菌株类型、来源及含菌量。大量研究已证实Nichols株适应兔睾丸内生长，而其他菌株较难适应兔睾丸内生长增殖[7]。不同类型菌株，其毒力不同。Nichol菌株毒力较大，1～2个Tp即可引起睾丸炎发生。如同样接种100万Tp，Nichols菌株和Gand菌株的持续时间分别为6～8天、39天[8]。另外，菌株来源广泛，如梅毒患者血液、皮损分泌物、脑脊液、皮损组织等，Gayet-Ageron等[9]对Tp-PCR的敏感性及特异性进行分析，发现一期梅毒患者硬下疳分泌物和先天梅毒新生儿血液中敏感性最高。Tong等[10]对梅毒兔感染试验(RIT)进行再评估，结果显示一期患者皮损分泌物比神经梅毒脑脊液的RIT阳性率高，且脑脊液感染所需时间更长，同时作者对样本分析发现服用抗生素治疗后的临床样本RIT阳性率较低。最新研究表明，一期、二期梅毒患者全血中Tp-DNA较潜伏梅毒高，且检出率与患者RPR滴度有相关性[11]。可见，一期、二期梅毒患者更容易取到Tp。冷冻菌株感染性较弱，但可能由于菌株保存过程中菌活力降低，所以发病期延长[12]。1925年，Chesney等[13]实验显示接种菌量主要影响潜伏期和持续时间，即菌量越多，潜伏期越短，而对疾病发展无明显影响,接种最少致病菌量，同样可使产生明显的损害。

其次为宿主，即兔及实验条件因素。1923年，Chesney等[14]探究了兔性别与年龄对梅毒兔模型的影响，发现年龄小于6个月且睾丸成熟的雄兔对Tp反应更加明显，所以推荐选用睾丸成熟且年龄小的雄兔作为梅毒兔模型。接种前后，兔需无抗生素食物喂养，当体内含有抗生素时，菌株侵袭力降低。因Tp对较高温度不耐受，当接种后皮肤温度20℃以上时，皮损较轻，孵育期较长，说明低温有利于Tp的增殖，大量实验证明饲养温度保持18℃～20℃有利于Tp生长及兔皮损形成。在夏季，尽管严格控制温度，Tp生长和皮损形成缺乏稳定性，可能由于兔体内激素发生变化[7]。新西兰兔实验前应在实验动物房内至少饲养一周，使其熟悉适应实验条件，有助于减少不良反应甚至死亡发生。接种前有必要禁饮食，以防麻醉时发生胃内容物反流而误吸引起吸入性肺炎致命。接种后，应密切观察饮食、身体变化等，当实验前后饮食量及身体变化较大时，应分析原因，做好准备措施，以预防兔死亡。同一菌株A接种于不同新西兰兔，TPPA转阳时间及临床改变不尽相同，推测可能由于兔自身的免疫功能差异所决定。接种Tp同时注射激素，可增加皮损内Tp数量，有助于皮损形成[15]。

梅毒兔模型的构建，不仅受菌株因素、兔及实验条件的影响，另外实验方法同样重要。Tp抵抗力极弱，对热及干燥均特别敏感。血液中4℃放置72～120 h后死亡[16]，56℃加热5 min死亡或离体后干燥1～2 h即死亡，对常用化学消毒剂敏感，10～29 g/L石碳酸内数分钟死亡体外存活时间较短，所以需要在菌株分离、收集后的1 h内完成接种，这就要求实验前应准备好试剂、器材，获取Tp后快速接种，以免错过最佳存活时机，从而影响菌株的增殖。制备菌悬液时，可加入10%～50%正常兔血清延长Tp体外存活时间。虽有文献报道Tp可体外存活数小时，但随着时间的延长会降低接种成活率，所以推荐尽快接种。Tp传代方法很多，如皮内、静脉、颅内注射，依据实验目的选择接种方式，但传统以睾丸内注射为主。Chesney等[14]通过睾丸接种与皮内接种进行比较探究了两者对梅毒兔模型的影响，结果显示睾丸内接种的兔出现早期反应更加剧烈，全身损害的比率更高。国内研究者对睾丸内注射方法和皮下注射方法进行对比，发现前者TPPA、RPR转阳时间较早，RPR滴度较高，临床症状发生率高[17]。