苹果醋冷冻浓缩过程有机酸含量变化及抗氧化能力研究

门戈阳，李湘勤，钟平娟，钟瑞敏，*，单斌，谢思芸，丘平

（1.韶关学院英东食品科学与工程学院，广东 韶关 512005；2.韶关学院 物理与机电工程学院，广东 韶关 512005；3.南昌大学 食品学院，江西 南昌 330047）

苹果醋（apple cider vinegar）是以苹果为主要原料，经酒精发酵、醋酸发酵制成的具有独特酯香和果香的一种酸味产品，其酸味质量体现在有机酸的含量和组成上，其中有机酸除主要的乙酸外，还含有苹果酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸等不挥发酸，这些有机酸决定了苹果醋的酸味质量，尤其是苹果酸和琥珀酸具有缓冲乙酸的刺激性，提高酸味平和性，使果醋酸味柔和、口感醇厚的作用，在很大程度上改善了果醋的不良刺激口感，同时赋予了果醋特征性的酸味，这对于风味较淡的苹果醋产品质量来说极为重要。发酵型苹果醋由于发酵条件较温和，能够有效保留苹果中的营养成分，同时发酵过程中也产生了多种天然抗氧化剂等活性物质如酚类、黄酮类、维生素C、氨基酸等物质，可提高人体免疫力和具有保健等功能[1-2]。将发酵苹果醋与冷冻浓缩技术相结合在国内外都鲜有研究，虽然国内冷冻浓缩起步较晚，但近10年来也开展了冷冻浓缩技术装备在果汁、果酒等领域的应用研究[3-7]。采用分光光度法在517 nm 波长处可以检测苹果醋对DPPH 自由基的清除效果，评价其抗氧化能力。其能力用清除率来表示，清除率越大，其抗氧化能力越强[8]。

为了进一步评价苹果醋的冷冻浓缩效果，本试验中采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）和分光光度法分别对苹果原醋及冷冻浓缩过成中有机酸的含量和抗氧化能力进行分析测定，以阐明苹果原醋中的主要有机酸含量及其抗氧化能力在浓缩过程中的变化，为苹果醋冷冻浓缩技术的评价及改进提供理论依据和研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苹果原醋（浓度5 %）：企业提供；苹果醋冷冻浓缩过程样液：试验过程中得到，苹果醋一级浓缩过程液：浓度5 %～12.5 %；苹果醋二级浓缩过程液：浓度12.5%～25.0%；苹果醋二级夹带：浓度6.7%；苹果醋一级夹带/夹带回收初始液：浓度1.9%；苹果醋夹带回收液：6.9%；终极夹带：0.1%。

DL-苹果酸（99%）、柠檬酸（98%）、琥珀酸（99%）乙酸（99.8%）（HPLC 纯）：北京百灵威科技有限公司；D-乳酸（98%）（HPLC 纯）：西亚试剂；磷酸氢二铵（分析纯）：西陇化工股份有限公司；磷酸（分析纯）：天津市广成化学试剂有限公司；二苯基苦味肼基自由基（分析纯）：东京化成工业株式会社；乙醇（分析纯）：天津市富宇精细化工有限公司；甲醇（HPLC 纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司

1.2 仪器与设备

多功能冷冻浓缩机组：韶关学院广东高校粤北特色食品工程技术开发中心自行设计；pH 计（FE20）：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；分析天平（BS124S）：赛多利斯（北京）公司；台式高速离心机（TGL20M-Ⅱ）：盐城市凯特实验仪器有限公司；高效液相色谱仪（LC-15C）：日本岛津公司；分光光度计（76 新世纪）：北京普析通用仪器有限责任公司；超纯水过滤装置（022246）：RES.JSCIENTIFIC INSTRUMENTSCO.LTD。

1.3 方法

1.3.1 冷冻浓缩样品处理

将浓度为5%苹果原醋采用韶关学院广东高校粤北特色食品工程技术开发中心自行设计的渐进式冷冻浓缩机组进行两级浓缩，得到一级浓缩液（12.5%）、二级浓缩液（25%）及相应夹带液（冷冻浓缩结束放出浓缩液剩下的夹带冰环溶解后的液体），每隔2 h 取样进行浓度测定和有机酸含量的测定。浓缩复原液及相应夹带进行抗氧化能力测定。F1 表示一级浓缩，F2 表示二级浓缩。

1.3.2 苹果醋有机酸含量测定

1.3.2.1 样品处理

将苹果醋一级浓缩、二级浓缩过程样液及夹带回收液（高于原醋浓度），用蒸馏水稀释复原至原醋浓度（5.0%），然后同原醋一起稀释至浓度为1.0%，低于原醋浓度的一、二级夹带液稀释至1.0 %，终极夹带（0.1 %）不作稀释处理，所有样品均用0.45 μm 针式有机相滤头过滤于1.5 mL 进样瓶中。

1.3.2.2 标品处理

精密称取苹果酸0.500 0 g、乳酸0.200 0 g、乙酸10.000 0 g、柠檬酸 0.150 0 g、琥珀酸 0.150 0 g，用超纯水溶解定容至100 mL。苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸的质量浓度分别为 5.0、2.0、100、1.5、1.5 mg/mL，此为混合有机酸标准使用液。取适宜浓度标准使用液，用超纯水定容至10 mL，混匀，得到系列混合标准溶液。将系列混合标准溶液经0.45 μm 微孔滤膜过滤后进样，以峰面积（X）对有机酸含量（Y）求标准曲线回归方程及相关系数。

1.3.2.3 色谱条件

1）检测波长的确定：由于210 nm 紫外光对柠檬酸、苹果酸、乙酸、乳酸和琥珀酸标准溶液有较强的吸收，并且光谱重复性好，最终确定检测波长为210 nm。

2）流动相的选择：为避免干扰有机酸的检测，选择在紫外区几乎无吸收的磷酸盐缓冲溶液作为流动相。常用的流动相体系有磷酸盐缓冲液-甲醇、磷酸盐缓冲液-乙腈、磷酸盐缓冲液-甲醇-乙腈系列，因有机酸极性较大，流动相中水含量很高，会使酸产生电离，为了使有机酸尽可能以分子形式存在，一般使用磷酸调节pH 值使之成为酸性流动相来抑制有机酸的解离。本试验选取流动相磷酸氢二铵的浓度分别为0、0.01、0.02 mol/L，流动相 pH 值 为 2.5、2.7、2.8、3.0，流动相配比为95%，98%和100%，流速为 0.5、0.8、1 mL/min，在20、30、40℃柱温条件下时的分离效果，试验结果表明，在流动相中没有磷酸盐缓冲液时，有机酸的分离效果很不好，在流动相中加入适量的甲醇，可以使各组分的保留时间缩短，并且抑制拖尾现象，改善峰形。当pH 值太低时，对色谱柱损害很大，随着磷酸盐浓度的增加，各种有机酸能够得到分离，但是pH 值太高时，分离效果并不好，并且磷酸盐的浓度过高，容易结晶造成色谱柱堵塞损坏色谱柱。当流动相流速太高时，柱压升高，分离度降低，对色谱柱损害较大；流速太低，柱压低，峰较宽，分离时间长。而柱温升高会加快传质过程，缩小分离度[9-12]。因此，综合考虑流动相条件选择如下：

Eclipse XDB-C18 柱（4.6 mm×250 mm）5 μm，流动相：2%甲醇-98%0.01 mol/L 磷酸氢二铵-磷酸缓冲液，pH 值为2.8；检测器：紫外检测器；检测波长：210 nm；柱温：30℃；流速：1.00 mL/min；进样量：10 μL。两次平行。

1.3.3 DPPH 自由基清除试验[13-14]

1）DPPH 母液：准确称取 DPPH 0.046 8 g，用无水乙醇定容于500 mL 容量瓶内，充分摇匀，4℃冰箱避光保存，备用。

2）样品测定：取上述母液稀释一倍为反应液，分别移取苹果醋原液、一级浓缩液、二级浓缩液、二级夹带液、一级夹带液、夹带回收初始液、夹带回收液、终极夹带液各1 mL，加入DPPH 反应液5 mL，充分摇匀，黑暗处静止30 min 后，3 000 r/min 离心，取上清液，于517 nm处测吸光值，平行测定3 次，取平均值，按如下公式计算其DPPH 自由基清除率（E）：

式中：Ai为醋液加DPPH 溶液的吸光度；Aj为蒸馏水加DPPH 溶液的吸光度；A0为醋液加乙醇溶液的吸光度。

2 结果与分析

2.1 苹果醋冷冻浓缩原醋及过程样有机酸结果分析

通过高效液相色谱法测得各有机酸保留时间见图1。

图1 有机酸混合标准溶液高效液相色谱图Fig.1 The high performance liquid chromatogram of the organic acids mixture standard solution

由图1可得D-苹果酸保留时间为3.533 min，乳酸保留时间为4.141 min，乙酸保留时间为4.407 min，L-苹果酸保留时间为4.977 min，琥珀酸保留时间为5.391 min，柠檬酸保留时间为6.146 min。高效液相色谱法测得原醋及各级浓缩苹果醋液、夹带液中D-苹果酸，乳酸，乙酸，L-苹果醋，琥珀酸和柠檬酸的含量见图2。

经测定知苹果原醋中柠檬酸含量极少，可忽略不计，故分析剩余5种有机酸含量在浓缩过程中的变化。

为验证方法的准确度和可靠性，采用与测定苹果醋样完全一致的方法，在最佳试验条件下将苹果原醋重复进样8 次，测定有机酸的精密度，同时进行加标测定原醋中5种有机酸含量的回收率，即在原醋样品中加入 225 μg/100 mL 的苹果酸、500 μg/100 mL 的乳酸、6 000 μg/100 mL 的乙酸、80 μg/100 mL 的琥珀酸进行测定。结果见表1。

经测定，各有机酸加标回收率见表2。

由表2可知，各有机酸的回收率介于96.2 %～102.3%之间，相对标准偏差RSD（n=8）≤3.4%，表明该测定方法准确可靠，回收率高，重现性好。

苹果醋两级冷冻浓缩过程的变化见图3。

由图3可以看出在一级冷冻浓缩过程中料液浓度开始增加逐渐加快，到后期开始增加缓慢，说明此时的冷媒温度与料液中心温度差已经趋于平衡，温差作为驱动力以不足以使浓缩较好的进行下去，同时冰环厚度的增加导致的传热效率降低，也不利于浓缩继续进行，此时及时终止一级浓缩将料液从结晶罐底放出，低温将夹带冰溶解，开启二级浓缩。同样，二级浓缩前期料液浓度增加较快，随着冷冻浓缩的进行料液浓度变化趋势同一级浓缩。

图2 7种苹果醋处理液中5种有机酸含量高效液相色谱图Fig.2 The high performance liquid chromatogram diagram about five kinds of organic acids content in seven kinds of different apple cider vinegar

表1 原醋中5种有机酸含量的精密度测定（n=8）Table 1 The precision of five kinds of organic acids content in the original vinegar（n=8）

表2 原醋中5种有机酸含量的加标回收率测定Table 2 Standard addition recovery rate determination of the five kinds of organic acids content in original vinegar

7种苹果醋处理液中有机酸含量和冷冻浓缩过程复原液中有机酸含量变化见表3、图4。

在苹果醋中最主要的有机酸为乙酸，琥珀酸含量较少，经过两级浓缩有机酸总损失率为3.45%。在两级冷冻浓缩过程中，浓缩液复原后这5种有机酸含量都呈现出不同程度下降的趋势，虽然过程样液有机酸含量些许波动，但仍可见其下降趋势。其中乙酸可以较明显看出在第一阶段中下降速率较缓慢，但在后期即第二阶段则下降较快，可能是因为二级浓缩初始浓度较大，冰环生长过程中夹裹的乙酸分子要比一级浓缩多，导致二级浓缩过程中乙酸含量降低速率较大。

图3 苹果醋两级冷冻浓缩过程浓度变化曲线图Fig.3 The graph of concentration change of apple cider vinegar in two levels of freeze concentration processes

表3 7种苹果醋处理液中5种有机酸含量汇总Table 3 Summaries of five kinds of organic acids content in the seven kinds of apple cider vinegar process modes

图4 苹果醋冷冻浓缩过程复原液中5种有机酸含量变化曲线图Fig.4 The changing graph of the five organic acids content of apple cider vinegar recoveries in freeze concentration process

苹果醋经过两级浓缩复原后有机酸含量的损失率见表4，苹果原醋经过一级冷冻浓缩后复原液中5种有机酸的保存率介于86.52%～95.77%之间，其中醋酸的保存率最高，达到95.77%；而经过两级冷冻浓缩后复原液中5种有机酸的保存率则介于79.10%～88.71%之间，同样是醋酸的保存率最高，达到88.71%。而终极夹带的有机酸总损失率仅为3.00%，说明冷冻浓缩还是可以很大程度上保留原醋中有机酸的含量，尤其是含量较高的乙酸、D-苹果酸。

二级浓缩由于被浓缩的基料浓度比一级浓缩的大，在浓缩过程中浓差极化现象也会更为明显，这样会导致溶质在夹带冰中的浓度也会更大。由试验结果也可知，二级夹带和夹带回收液浓度较高，有机酸含量也较高，仍有利用价值，针对这种情况，可考虑再次与原醋混合进行循环浓缩试验，对浓度相对较低的一级夹带冰则进行回收浓缩。而终极夹带由于其0.1%的较低浓度，其中所含有机酸含量也微乎其微，建议舍弃不予回收。

表4 苹果醋经过一级、二级浓缩复原后有机酸含量的损失率Table 4 The loss rate of the organic acid content in apple cider vinegar after primary and secondary concentration recovery

2.2 苹果醋清除DPPH自由基能力

7种苹果醋处理液中自由基清除能力见图5。

图5 不同处理方式的苹果醋清除自由基能力Fig.5 Different treatments of apple cider vinegar ability of scavenging free radicals

浓度为5.0 %的苹果原醋自由基清除能力为74.55%，同浓度的一级浓缩复原液和二级浓缩复原液的自由基清除能力分别为69.19%和67.24%。浓度为6.7%的二级夹带自由基清除能力为75.30%，6.9%的夹带回收液自由基清除能力为77.29%，这二者由于浓度高于原醋浓度所以自由基清除能力也高于原醋，一级夹带和终极夹带的清除率都在30%以下，终极夹带的清除率17.66%已经非常弱了。由此可以看出苹果原醋经过两级浓缩后自由清除率仅降低了7.31%，产生的终极夹带抗氧化性已很弱，说明冷冻浓缩是可以很好地保护苹果醋中的抗氧化物质的。二级夹带和夹带回收液的高浓度也提高了自由基的清除能力，说明二级夹带和夹带回收液中仍有较强的抗氧化能力，具有较高利用价值，可与原醋混合继续进行浓缩。

3 结论

苹果原醋经过一级、二级冷冻浓缩后，苹果酸、乳酸、乙酸和琥珀酸等有机酸含量有所降低，保留率介于79.10%～88.71%之间，主要有机酸乙酸仅损失3.03%，有机酸整体保留率在95%以上。终极夹带的有机酸总损失率仅为3.45%，说明冷冻浓缩还是可以很大程度上保留原醋中有机酸的含量，尤其是含量较高的乙酸、D-苹果酸。经过两级浓缩后的复原液自由基清除率和原醋相比仅降低7.31%。得到的二级夹带和夹带回收液仍有较高的浓度和有机酸含量，且抗氧化能力也较高，仍有利用价值，针对这种情况，可考虑再次与原醋混合进行循环浓缩试验，对浓度相对较低的一级夹带则进行回收浓缩。而终极夹带由于其0.1%的较低浓度，其中所含有机酸含量也微乎其微，抗氧化能力也很弱，可予以丢弃不必再次回收。