棉花GhPAO3基因的CRISPR/Cas9表达载体的构建

朱雪峰，田文刚，熊显鹏，薛 飞，张 莉，朱华国

(石河子大学/新疆生产建设兵团绿洲生态农业重点实验室，新疆石河子832003)

0 引 言

【研究意义】随着我国科技的进步，棉花种植技术日益成熟，我国目前已经进入棉花高产国行列[1]。虽然我国棉花产业发展迅速，但是仍有许多问题亟待解决[2]。如干旱与盐渍化是我国农业生产主要的非生物胁迫因素，影响棉花产量与棉纤维质量，造成棉纺织业成本上升[3-4]。培育抗盐碱能力强的棉花新种质成为育种新目标，而培育出这些新种质需要以棉花生物学作为理论基础,以棉花功能基因组学来解析调控农艺性状的基因网络[5]。近年来发展迅速的基因编辑技术为挖掘与检验调控棉花农艺性状的关键基因提供了新的思路，而且为创建新的棉花种植资源提供了新的手段[6]。研究多胺氧化酶基因对提高棉花抗逆能力有一定的理论和实践意义。而CRISPR/Cas9技术的出现及发展，为研究多胺氧化酶基因提供了便捷、可靠的手段。【前人研究进展】基因编辑技术可以改变基因组序列，定点编辑目标基因，是人们验证特定基因功能的一种手段[7]。CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-as-sociated protein)系统是一种新兴起的基因定点编辑技术，它是基于细菌获得性免疫系统原理改造而成的一种全新的人工核酸酶系统，因其操作简单，编辑效率高，已被广泛应用于包括植物在内的多种生物中[8]。CRISPR/Cas9 系统的原理是Cas9蛋白可以在由crRNA与 tracrRNA 形成的sgRNA 的引导下，切割靶标基因，形成DSBs (double-stranded DNA breaks)，通过生物体内的NHEJ (non-homologous end joining)修复机制引起基因突变[9-10]。CRISPR/Cas9 基因组编辑技术体系中 U6 或 U3 启动子是驱动sgRNA 转录的重要元件,最近利用拟南芥U6启动子在棉花(GossypiumhirsutumLinn, 陆地棉)中已成功建立了高效CRISPR/Cas9 基因组编辑技术体系[11-13]。多胺氧化酶(Polyamine oxidase,PAO)是指催化腐胺、亚精胺和精胺等多胺类物质氧化降解的酶类。在研究模式植物拟南芥(Arabidopsis,thaliana) PAO基因的功能及其调控途径的过程中发现，其有5个PAO同源基因[14]，控制拟南芥的多胺代谢。在金盏花中，外源添加亚精胺可以调节过氧化物酶活性与脯氨酸含量，外源添加精胺可以增强金盏花过氧化氢酶活性，提高抗盐能力[15]。精胺含量的上升能有效提高三叶草的抗旱能力[16]。添加外源亚精胺可以增强玉米对干旱胁迫的耐受性[17]。前期研究中发现，在拟南芥中过表达GhPAO3基因可以降低拟南芥体内的精胺含量，从而提高拟南芥的抗盐能力[18]。【本研究切入点】所使用的表达载体为pRGEB32-7载体，可以串联多个tRNA+靶标+gRNA，从而提高突变效率，植物自身的RNase P和RNase Z可以分别切割tRNA的5’端和3’端，可以将多个靶标的gRNA释放，与目标序列互补后， Cas9/ gRNA会在PAM前3 bp左右的位置精确切割靶DNA双链。通过CRISPR系统将靶标切断后，生物会启动自身修复机制，在修复后产生突变，导致目标基因功能沉默。研究多胺氧化酶基因,提高棉花抗逆能力。【拟解决的关键问题】以棉花为材料，筛选合适靶点设计引物，经三次重叠延伸PCR与一次酶切连接后，构建敲除GhPAO3基因的CRISPR/Cas9的载体。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株与质粒

使用的CRISPR/Cas9植物基因敲除载体是pRGEB32-7(来自于华中农业大学金双侠课题组)，所用菌株为大肠杆菌E.coliDH5α，农杆菌菌株LBA4404。

1.1.2 主要酶及试剂

Ex-Taq酶(TaKaRa 公司)、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(北京全式金公司)、BsaⅠ(New England Biolabs公司)、Exnase Ⅱ(南京诺唯赞公司)。

1.2 方 法

1.2.1GhPAO3 基因敲除靶位引物序列设计

GhPAO3基因靶标选择参考了CRISPR-P网站(http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR)，通过上传GhPAO3基因外显子序列，搜索并选择分数较高的序列。选出的序列进行Blast，确定具有特异性的序列，则选择由该靶点设计得到的引物。

1.2.2 小片段的扩增与连接

设计好的引物送公司合成(北京六合华大公司)，纯化级别为PAGE。通过两次PCR得到两个靶点的小片段，由于引物的5’端加入了接头，PCR产物中将会带有接头的互补序列，通过第三次PCR可以将两个小片段连接起来。PCR扩增体系为20 μL体系，反应条件：95℃,4 min；95 ℃，30s；55℃，30s；72℃，20s，3个循环；95℃，30s；60℃，30s；72℃，20s，27个循环，最后72℃延伸5 min。通过在引物的5’端加入接头，使PCR产物带有互补序列的接头，通过第三次PCR使两个独立的PCR产物借助接头经Taq酶延伸成为融合片段。图1,表1

图1 重叠延伸
Fig.1 Overlapping extension
表1 第一、二次PCR体系
Table 1 First and second PCR system

20 μL体系20 μLsystem第一次PCR (μL) 第二次PCR The first PCR (μL) The second PCR (μL)ddH2OBufferdNTPSprimerASprimerEx Taq模板16.1 220.3pRGEB32-7s 0.2 GhPAO3-1as 0.2 pGTR4质粒16.10.20.3GhPAO3-2s 0.2 GhPAO3-2as 0.21pGTR4质粒1

注：pGTR4质粒为中间载体质粒，来自华中农业大学金双侠教授课题组

Note: pGTR4 plasmid is an intermediate vector plasmid from Professor Jin Shuangxia of Huazhong Agricultural University

1.2.3 载体酶切与连接

取pRGEB32-7载体，使用限制性核酸内切酶BsaⅠ进行单酶切。100 μL酶切体系，其中pRGEB32-7载体15 μL，10x cut smart Buffer 10 μL，BsaⅠ 酶4 μL，ddH2O补足至100 μL。37℃酶切5.5 h，可以适当延长酶切时间，使反应更充分。连接载体使用一步法，其中目的片段100 ng，线性化表达载体100 ng，Exnase Ⅱ 酶1 μL，CE Buffer 2 μL。37℃水浴30 min，冰浴5 min。连接产物可以-20℃长期保存。

2 结果与分析

2.1 靶点选择与引物合成

根据 CRISPR/Cas9 技术原理，在GhPAO3基因的外显子上，根据CRISPR-P网站给出的序列，选择一段20 bp的序列(5′-TATAATCGAATACCTCGCGT-3′)作为靶点。该序列3′端PAM序列为CGG，Cas9蛋白将在其上游3 bp左右精确切割靶DNA双链。根据该靶点得到相应引物，并在引物后添加接头，方便后续连接实验。表2

表2 PCR相关引物
Table 2 PCR related primers

引物名称Primer name引物序列Primer sequenceGhPAO3-1asGhPAO3-1sGhPAO3-2asInfPAO3aspRGEB32-7sInfpRGEB32-7sU6-7sTATCGACACTTAAGAACtgcaccagccgggaa (靶标1互补序列)GTTCTTAAAAAGTGTCGATAgtttagagctagaaata (靶标1序列)ACGCGAGGTAT TCGATTATAtgcacagcggaat (靶标2互补序列)ttctagctctaaaCACGCGAGGTATTCGATTATA (靶标2互补序列)CAGCACATAACTGGCAAACAAAGCACCAGTGGTCTAGCAGCACATAACTGGCAAACAAATGTGCCACTCCAAAGACATCAG

注：小写部分为载体固定序列，引物pRGEB32-7s、U6-7s与InfpRGEB32-7s为载体通用引物

Note：The lower case is the vector-fixed sequence, and the primers pRGEB32-7s, U6-7s and Inf pRGEB32-7s are the universal primers for the vector

2.2 靶位点片段的验证

以中间载体pGTR4质粒为模板，分别以pRGEB32-7 s 、GhPAO3-1 as 和GhPAO3-2s 、GhPAO3-2 as为引物，进行第一、二次PCR。PCR产物进行电泳检测，两次PCR条带大小分别约为150 bp与200 bp(图2A)。以前两次PCR产物为模板， InfpRGEB32-7 s与InfGhPAO3 as为上下游引物进行第三次PCR，连接两个小片段。PCR条件为：95℃，4 min；95℃，30 s；59℃，30 s；72℃，20 s，27个循环，最后72℃延伸5 min。PCR产物进行电泳检测，条带大小约为400 bp(图2B)。图2

图2 A图是第一与第二次PCR产物电泳图，条带大小分别为100 bp与250 bpB图是第三次PCR产物电泳图，条带大小约为400 bp
Fig.2 Figure A is the first and second PCR product electropherogram, the size of stripe is 100 bp and 250 bp respectively.Figure B is the third PCR product electropherogram,the size of stripe is about 400 bp

2.3 酶切验证与感受态的转化

酶切产物进行电泳检测，得到线性pRGEB32-7载体条带，大小约为16 kb(图3A)。将得到的条带进行胶回收，回收产物测浓度后用于载体连接。

取2～5 μL连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，重组后的pRGEB32-7载体带有卡那抗性，挑取4～5个单克隆，用于PCR阳性检测并送菌液测序。PCR阳性检测使用引物为通用引物U6-7s与InfPAO3as(图3B)。送PCR验证正确的菌液去测序，测序结果正确。图3

图3 A图为载体酶切电泳结果；B图为阳性菌液鉴定电泳
Fig.3 Figure A shows the results of vector digestion electrophoresis；Figure B is the positive bacterial solution identification electrophoresis results

2.4 农杆菌转化

对含有测序正确的pRGEB32-7载体的菌液提质粒，采用电击转化法转化农杆菌LBA4404感受态，菌液PCR验证阳性后甘油保存于-80℃，用于后续棉花转化培养实验。

3 讨 论

所用的Cas9中间载体为pGTR4载体， tRNA + gRNA组合序列已经被插入pGTR4载体中，两个小片段可以从该载体中扩增出来，两个小片段连接在一起可以构成完整的tRNA+靶标+gRNA。因为在合成引物时添加了接头序列，在连接的过程中更为便捷，从而整体简化了操作过程。与新疆农业大学农业生物技术重点实验室的pCAMBⅠA1300载体相比较[19]，操作更为简单，只需要三次PCR与一次酶切连接便可构建出敲除目标基因的Cas9表达载体。

目前，以基因编辑为基础的反向遗传学技术是基因改造与研究的手段之一[20]。基因组编辑通过特异性结构识别目标基因，改造基因DNA来改变基因组中的特定基因，从而定点修复致病基因[21]或定点插入一个基因或DNA元件[22]，也可以定点编辑正常基因，对正常基因进行敲除、结构修饰，利用该技术研究单一基因在体内的功能。目前常用的基因编辑技术有锌指核酸酶(zinc-finger nucleases，简称ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease, TALEN)和CRISPR/Cas9。与其他两种技术相比，CRISPR/Cas9技术有着脱靶率相对较低，编辑效率高的优点。棉花中一直存在基因组较大，转化比较困难等问题，所以在基因编辑方面进展缓慢，只有CRISPR/Cas9技术在棉花中有报道。

在研究棉花基因功能中，常用的基因沉默方法有病毒介导的棉花基因沉默体系(virus-induced gene silencing,VIGS)、RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术与基因编辑技术。VIGS技术属于转录后的基因沉默，能使靶标基因在mRNA水平上显著降低，从而降低靶标基因的表达量。RNAi技术是RNA水平的沉默，可以使靶标基因产生的mRNA降解，从而使靶标基因表达量下调。与VIGS和RNAi技术相比较， CRISPR/Cas9技术是基因组水平上的敲除，具有编辑效率高，沉默准确性高，能稳定遗传的特点。

构建棉花GhPAO3基因的Cas9表达载体具有较大研究价值。研究系统介绍了定向构建一个编辑棉花多胺氧化相关基因GhPAO3的CRISPR/Cas9载体的方法，为研究GhPAO3基因奠定基础，同时为研究CRISPR/Cas9载体构建提供参考。

4 结 论

中间载体为pGTR4，表达载体为pRGEB32-7，筛选标记是卡那霉素筛选标记。在GhPAO3基因序列中选出合适的靶标，设计引物。通过三次重叠延伸PCR，构建出tRNA+靶标+gRNA的序列，使用限制性核酸内切酶BsaⅠ 对表达载体pRGEB32-7进行一次单酶切，采用一步法将构建出的tRNA+靶标+gRNA序列连接在线性化的表达载体pRGEB32-7上，将靶基因的靶点序列插入载体中，构建出敲除棉花GhPAO3基因的Cas9表达载体。