新疆棉田根际土壤真菌荧光PCR技术定量及其时空动态分析

党文芳，李雪艳，杨红梅，楚 敏，高 雁，曾 军，霍向东，张 涛，林 青，欧提库尔，李玉国，娄 恺，史应武,3,4

(1.新疆大学生命科学与技术学院,乌鲁木齐 830052；2.新疆农业科学院微生物应用研究所 ,乌鲁木齐830091；3.新疆特殊环境微生物实验室,乌鲁木齐 830091；4.农业农村部西北绿洲农业环境重点实验室,乌鲁木齐830091)

0 引 言

【研究意义】真菌作为构成土壤微生物群落的重要组成部分之一，同时作为土壤中大部分微生物生物量的来源[1]，再加上棉花黄萎病是一种土传真菌引起的病害，所以土壤真菌的种类、定殖率和定殖量等因素都将成为直接影响真菌对宿主植物效应的关键因素。新疆棉花黄萎病的加剧成为制约新疆棉田产量及棉花纤维品质的因素之一。棉花黄萎病是一种土传真菌病害，目前，用于防治棉花黄萎病报道最多也最有发展前景的防治办法为生物防治。了解新疆棉田根际土壤微生物动态变化对于生防微生物的筛选及其应用都能提供很好的理论依据。棉花黄萎病根际土壤真菌定量分析对揭示棉花根际土壤真菌影响黄萎病发生、以及微生态调控黄萎病具有重要意义。【前人研究进展】刘会梅等[2]评价了传统的土壤真菌分离和计数方法：分离工作量大，耗时多；直接计数法估计的真菌总数低于实际存在，间接计数法存在不能区分这些真菌是死菌还是活菌的问题，不能全面反映土壤真菌的实际情况。顾美英等[3]以棉田黄萎病发病植株与健康植株根际土壤作为对象，以稀释平板法研究了根际土壤微生物的数量变化情况。高峰等[4]利用巢式PCR技术对土壤中病原菌进行了初步定性检测，而对于定量还未做具体研究。有关分子生物学的很多方法在细菌检测中应用的很多，而在真菌中应用的则相对较少[5]。随着 PCR 技术的不断发展应用[6-7]，植物各组织中内生真菌的含量测定已多采用实时荧光定量 PCR (RT-qPCR)法[8-11]，结果显示，该方法可以实时的对内生真菌的变化情况进行较全面的分析。2011 年，肖蕊等[11]用SYBR Green I 荧光定量 PCR 检测方法对土壤中棉花黄萎病病原菌进行定量，并对该方法进行了评价。【本研究切入点】实时荧光定量PCR检测技术是一种方便、快速、准确、用样量小、非微生物培养的定量方法[12-14]，其检测原理是在反应体系中加入荧光基团，在整个监测进程中利用荧光信号积累来反应体系变化，后通过生成标准曲线进行定量分析未知样品的一种方法[15-20]。实时荧光定量PCR检测技术同样也可用于土壤真菌的定量检测。研究新疆棉田根际土壤真菌荧光PCR技术定量及其时空动态。【拟解决的关键问题】研究采用实时荧光定量PCR技术，建立棉田根际土壤真菌定量分析的方法，对新疆主要棉花生态区棉花根际土壤进行调查，明确其根际土壤真菌分布规律及其与黄萎病病原菌数量的关系[17]。

1 材料与方法[18]

1.1 材 料

1.1.1 供试土样

分别在棉花的4个生育期(苗期、蕾期、花铃期和吐絮期)对新疆北疆地区的石河子(SHZ)、乌苏(WS)和精河(JH)；南疆地区的库尔勒(KEL)、图木舒克(TMSK)和阿拉尔(ALE)；东疆地区的哈密(HM) 7个植棉区进行土样采集。以棉株根际10～15 cm深的土壤为采样标准，分别标明为棉花病株还是棉花健株，采样后用直径为2 mm的筛网过筛、混匀后装入密封袋中保存在4 ℃冰箱中，待测。

1.1.2 主要试剂

试剂：Ezup柱式土壤基因组DNA抽提试剂盒(生物工程股份有限公司)；SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(生物工程股份有限公司)；SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(生物工程股份有限公司)。

1.1.3 主要仪器

仪器：Eppendorf Centeifuge 5417R型离心机(美国默飞世尔科技公司)；DW-40L188型医用低温保存箱(杭州艾普仪器设备有限公司)；T Personal型PCR仪(杭州博日科技有限公司)；DYCP-31E型电泳仪(北京六一仪器厂)；WD-9413B型凝胶成像分析仪(北京市六一仪器厂)；Epoch型超微量微孔板分光光度计(济南利科医疗器械有限公司)；Roche LightCyclerR480Ⅱ型实时荧光定量PCR仪(罗氏医学仪器公司)。

1.2 方 法[9]

1.2.1 棉花根际土壤微生物基因组总DNA的提取

利用土壤基因组DNA抽提试剂盒对棉花病株根际土壤和棉花健株根际土壤基因组总DNA进行提取。将提取的DNA样品保存在-20℃冰箱中。

1.2.2 RT-PCR反应体系的优化

应用真菌通用性引物0817F (5'- TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3')和1196R (5'- TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3')对土壤基因组总DNA进行扩增，探针用 FAM 和 BHQ1，同时设不加模板的为阴性对照，每个反应重复3次。根据反应的Ct值、最佳退火温度及扩增效率(接近100%)对扩增体系进行优化，进而得到荧光定量PCR的反应体系为：模板5 μL，引物各0.8 μL，FS Essential DNA Probes Master 10.0 μL，探针0.4 μL，总体系为20 μL，95℃预变性10 min；95℃变性25 s，50℃退火120s，72℃延伸90s，共进行45个循环。

1.2.3 重组质粒的制备与鉴定[19]

对最佳扩增条件下得到的PCR扩增产物用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行纯化，将纯化的土壤真菌扩增物构建质粒后转化到大肠杆菌感受态细胞中，通过蓝白斑试验筛选出阳性转化菌。

1.2.4 标准曲线的建立

用质粒DNA小量抽提试剂盒提取上述阳性质粒DNA，再用超微量分光光度计测定质粒的OD值，进而计算质粒的浓度。把已获得的质粒稀释成不同浓度，用荧光定量检测已稀释的不同浓度质粒标准品，在Roche LightCycle 480软件内拷贝数据，用Origin 8.5软件作图并生成方程，建立Ct值与棉花根际土壤真菌浓度之间的线性关系。

1.2.5 样品的RT- qPCR检测

在最优扩增条件下对不同地区和生育期的棉花根际土壤真菌DNA样品进行PCR扩增，用RT-PCR对扩增后的根际土壤真菌进行定量检测，将得到的每个样品对应的Ct值带入上述重组质粒DNA构建的标准曲线方程中，计算棉花在不同生长期及所对应地区的根际土壤真菌的含量(copies/g FRW)。

1.2.6 棉花黄萎病病原菌的RT-qPCR

构建棉花黄萎病病原菌RT-PCR反应体系的优化及质粒标准品，以及标准曲线和标准方程的建立。其中以棉花根部组织总DNA为模板，进行 RT-PCR 检测，同时设无棉花黄萎病菌的空白对照，每个反应体系设3个重复。

1.2.7 棉花黄萎病病原菌与根际土壤真菌的相互关系

定量检测7个采样点棉花根部黄萎病病原菌和根际土壤真菌。用皮尔逊相关系数(Pearson correlation coefficient, PCC)分析黄萎病病原菌与根际土壤真菌的相关性，在SPSS 22软件中进行PCC分析。

1.3 数据处理

研究用Origin 8.5和Excel软件对数据作图，SPSS 22软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制[20]

根据已知重组质粒全序列计算质粒标准品的拷贝数为8.92×105copies/g (FRW)，以10倍梯度稀释标准品，获得8.92×105～8.92×105copies/g (FRW) 6个稀释梯度的标准品。将6个不同稀释度的标准品进行实时荧光定量PCR检测，将LightCyclerR480系统软件得到的数据进行作图。图1,图2

研究表明，曲线的相关性系数R2=0.993，说明标准品的浓度与循环数Ct之间的相关性较强；曲线的截距为30.797，斜率为-2.165 1。故棉花根际土壤真菌的DNA起始浓度对数值与Ct值之间的标准曲线方程为y=-2.165 1x+30.797，其中x为根际土壤真菌DNA起始浓度的对数值，y为扩增反应Ct值。图2

图1 10倍梯度稀释阳性质粒的荧光定量PCR扩增曲线
Fig.1 Real-time PCR amplifacation curve of serial 10-fold dilutions of positive recombinant plasmids

图2 10倍梯度稀释阳性质粒的荧光定量PCR标准曲线
Fig.2 RT-q PCR standard curve of serial 10-fold dilutions of positive recombinant plasmids

2.2 不同生育时期新疆棉花黄萎病病株根际土壤真菌数量

研究表明，在棉花四个生育期(苗期、蕾期、花铃期、吐絮期)，棉花病株根际土壤真菌数量最大值出现在吐絮期。库尔勒棉花病株根际土壤真菌在苗期达到最大，为4.23×104copies/g FRW，苗期到蕾期直线下降，随后变化趋势不大；阿拉尔棉花病株根际土壤真菌在苗期至蕾期逐渐增加，随后逐渐减小，在吐絮期达到最小，为1.41×10-4copies/g FRW；哈密棉花病株根际土壤真菌从苗期到花铃期呈现先增大后减小的趋势，花铃期到吐絮期直线增长，吐絮期达到最大，为6.16×104copies/g FRW；精河棉花病株根际土壤真菌在苗期最小，石河子、乌苏、精河和图木舒克棉花病株根际土壤真菌在苗期到花铃期变化趋势不大，花铃期到吐絮期逐渐增加。图3

图3 不同生育时期棉花黄萎病株根际土壤真菌数量变化
Fig.3 Variation of number of fungi in rhizosphere soil of cotton infected by Verticillium wilt at different growth stages

2.3 新疆不同地区棉花黄萎病株根际土壤真菌数量

研究表明，总体来看新疆棉花病株根际土壤真菌数量的空间变化是东疆大于南疆大于北疆。石河子、乌苏和精河在吐絮期棉花病株根际土壤真菌较多，首先是乌苏，其次是精河，最后是石河子；库尔勒棉花病株根际土壤真菌在苗期最多，为4.23×104copies/g FRW；图木舒克和阿拉尔的棉花病株根际土壤真菌在整个生育期都表现较少，哈密棉花病株根际土壤真菌在吐絮期呈现最多，为6.16×104copies/g 。图4

图4 不同地区棉花黄萎病株根际土壤真菌数量变化
Fig.4 Variation of number of fungi number in rhizosphere soil of cotton infected by Verticillium wilt at different regions

2.4 棉花根际土壤真菌与黄萎病菌数量的相互关系

采样点石河子的花铃期、阿拉尔的吐絮期其棉花根部病原菌分布较多，但根际土壤真菌分布较少，其他地区表现为棉花根部黄萎病病原菌分布较高的采样区同时期其根际土壤真菌分布也较高。在所测的七个样点中，苗期棉花黄萎病病原菌和根部土壤真菌的分布均较低。北疆棉花根部黄萎病病原菌分布的最大值较多出现在花铃期，而南疆和东疆一般出现在棉花吐絮期。石河子、乌苏均在花铃期棉花黄萎病病原菌分布最高，但在吐絮期根际土壤真菌分布最高。采样点阿拉尔的棉花根际土壤真菌数量分布在整个生育期的吐絮期为较小，而同期黄萎病病原菌数量分布最高。表1

研究表明，北疆精河和东疆哈密棉花根际土壤真菌数量与黄萎病病原菌数量的PCC分别高达0.989和0.993，呈显著正相关。而南疆图木舒克棉花根际土壤真菌数量与黄萎病病原菌数量的PCC为0.880，呈正相关。北疆石河子和乌苏、南疆库尔勒和阿拉尔棉花根际土壤真菌与黄萎病病原菌的PCC分别为-0.252 和-0.305、-0.539和-0.777，均呈负相关。表2

表1 棉花不同地区和生育期根部所带黄萎病病原菌数量及根际土壤真菌含量
Table 1 Number of pathogens of Verticillium wilt and rhizosphere soil fungi in roots of cotton in different regions and periods (copies/g FRW)

Sampling sites苗期Seeding stage蕾期Bud stage花铃期Flower stage吐絮期Boll opening stage病原菌Verticillium dahliaein根际土壤真菌Rhizosphere soil fungus病原菌Verticillium dahliaein根际土壤真菌Rhizosphere soil fungus病原菌Verticillium dahliaein根际土壤真菌Rhizosphere soil fungus病原菌Verticillium dahliaein根际土壤真菌Rhizosphere soil fungusSHZ118388.025 11771 186.645131 0060.372 60921 7109 983.443WS42.102 277249 451759.508 3131 200137.637 358 0882 0437.36JH46.60E-0514 302609.216 423 376301.179 228 52716 550.69KEL942 258.66515.25 144.1762 4025 361.2781 1145 244.056ALE4732 175.9338 7584 378.19333 1271 836.5775 767 6150.000 141TMS871 578.373806.92 254.67283 470298.614 3853 0605 141.67HM2323 142.353699.67 123.0341 8273 960.062483 46261 603.6

表2 不同采样点棉花根际土壤真菌与棉花黄萎病原菌数量的PCC
Table 2 PCC of the number of fungi and cottonVerticilliumwiltin the rhizosphere soil of cotton at different sampling points

Sampling locationsSHZWSJHKELALETMSHMPCC-0.252-0.3050.989*-0.539-0.7770.8800.993*

研究表明，各生育时期棉花根际土壤真菌数量与黄萎病病原菌数量均呈负相关。其中花铃期棉花内生真菌与黄萎病病原菌的 PCC为-0.620，其相关度较高。其他根际土壤真菌与黄萎病病原菌之间相关性均较低，如苗期棉花根际土壤真菌与黄萎病病原菌的 PCC 仅为-0.153。表3

表3 棉花不同生育期根际土壤真菌与棉花黄萎病原菌数量的PCC
Table 3 PCC of rhizosphere soil fungi and cottonVerticilliumwiltpathogens in different growth stages of cotton

Growth stagesSeedling stageBud stageFlower seasonBoll opening stagePCC-0.153-0.401-0.620-0.327

3 讨 论

目前，对于我国棉花内生真菌的研究还处于起步阶段，可见的报道也很少，我国棉花根际土壤真菌的报道更是少之又少。土壤作为棉花黄萎病土传灾害的来源，探究其与棉花黄萎病的关系是很重要的。2010 年，Tellenbach等[21]建立了植物内生真菌的方法。史应武等[17]建立了有关新疆棉花内生真菌的实时荧光定量PCR检测报道，张涛等[18]建立了有关新疆棉花根际土壤细菌实时荧光定量PCR的检测报道，李雪艳等[22]建立了有关新疆棉花内生细菌实时荧光定量PCR的检测报道，实验借鉴他们的方法开展新疆棉花根际土壤真菌的实时荧光定量PCR检测。除此之外，我国尚未报道过实时荧光定量PCR 技术检测棉花根际土壤真菌的研究。

4 结 论

新疆棉花病株根际土壤真菌数量在时间和空间上变化不尽相同，数量在空间变化上是东疆大于南疆大于北疆；数量在时间变化上是吐絮期最大，花期最小。但具体的变化趋势仍然不明朗，有待更系统全面的研究；且在不同的植棉区棉花病株根际土壤真菌的差异很大，这也说明了不同植棉区的土壤环境差异很大，该文只是初步探讨了新疆棉花黄萎病株根际土壤真菌的变化趋势，有关不同土壤环境对真菌的适应性还有待进一步的研究。

新疆棉花根际土壤真菌数量与黄萎病病原菌数量有一定的相关性，但总体上这种相关性在棉花不同生态区及其各个生育期并没有表现出明显的规律性，只是说明两者在棉花不同生态区表现为正相关，而在不同生育期则表现为负相关。在棉花不同生育期，根际土壤真菌数量与黄萎病病原菌数量呈较高的负相关性可能是因为随着棉花生育时期的推进，黄萎病病原菌在棉花根部大量繁殖，对棉花根际土壤的营养条件造成很大破坏，同时形成空间及营养竞争，导致根际土壤真菌不能很好的生长和繁殖。