基于PCR的两步法丝状真菌基因敲除方法

谢 鑫， 蒋君梅1， 王 勇1， 任明见

(1.贵州大学农学院， 贵阳 550025； 2.国家小麦改良中心贵州分中心， 贵州 贵阳 550025)

真菌在自然界广泛分布，与人类生活的各个方面都有着密不可分的联系[1]。因此对真菌进行研究，尤其对真菌的基因功能进行研究具有重要意义。通过对真菌DNA进行遗传改造是基因功能研究的重要技术，目前，对丝状真菌进行遗传改造的方法主要有PEG介导的原生质体转化、农杆菌介导的转化(A.tumeafeiensmediatedtransformation, ATMT)、电击转化和基因枪转化等[2-3]。基因敲除是研究基因功能的手段之一，利用同源重组原理对感兴趣的基因进行敲除，通过观察敲除突变体的表型变化从而明确该基因的功能，最终实现改良或防治真菌的目的。目前，常用的基因敲除的方法有： 1) 同源重组基因敲除，即利用基因两侧的同源臂在位点特异性DNA重组酶的作用下进行基因敲除，该法是最普遍的基因敲除方法； 2) 基因沉默(RNA silence)诱导的基因敲除，即通过构建小的双链RNA片段干扰基因的表达，并且这种干扰效应会持续“传递”到子代细胞，从而造成基因敲除； 3) 转座子和逆转录转座子标签法，即通过转座子在基因组中 “跳跃”，从而造成染色体的畸变或基因的缺失[4-6]。以上的基因敲除方法最终都需要筛选标记对敲除突变体进行筛选，丝状真菌基因敲除时常用的筛选标记有潮霉素、氯嘧磺隆(SUR)和G 418等[7]，存在筛选效率低、假阳性率高等缺点。因此，本研究对此做了改进，利用同源重组的原理，采用两步法PCR进行基因敲除，并利用潮霉素和绿色荧光蛋白(GFP)同时进行转化子的筛选，大大提高了筛选效率，其操作流程见图1。

图1 本研究流程图

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1供试菌株

稻瘟菌菌株GUY 11野生型菌株来自贵州大学植物病理学教研室。

1.1.2供试试剂

燕麦、水解酪蛋白、酵母提取物、蔗糖、酵母提取物、琼脂粉、溶菌酶(sigma)PEG 8000(sigma)、Tris-HCl、氯化钙、氯化钠、山梨醇、FastPfu Fly高保真酶(全式金)、pEASY-Blunt克隆载体(全式金)、苯酚、氯仿、乙醇、CTAB、金刚砂(sigma)等。

1.1.3培养基

燕麦培养基(1 L)：燕麦30 g(用料理机打碎)，琼脂粉15 g，蒸馏水定容至1 L，121 ℃灭菌20 min。

完全培养基(CM)：水解酪蛋白6 g，酵母提取物6 g，蔗糖10 g，蒸馏水定容至1 L，121 ℃灭菌20 min。

酶解液：0.1 g溶菌酶溶解并定容至10 mL 0.7 M NaCl溶液中，抽滤除菌。

1×STC(200 mL)：山梨醇43.6 g，50 mM Tris-HCl, pH=8.0 10 mL，50 mM CaCl210 mL，蒸馏水定容至200 mL，121 ℃灭菌20 min。

40%PTC(100 mL)：PEG 8000 4 g加1×STC定容至100 mL，抽滤除菌。

TB 3 培养基(1 L)：酵母提取物6 g，水解酪蛋白6 g，蔗糖200 g，蒸馏水定容至1 L，121 ℃灭菌20 min。

1.1.4实验设备

本实验所涉及的主要仪器有：离心机、光学显微镜、光照培养箱、荧光显微镜、摇床、料理机等。

1.2 试验方法

1.2.1稻瘟菌培养

将稻瘟菌接种于新鲜的燕麦培养基，25 ℃光照培养8～10 d。

1.2.2PCR扩增、连接等分子生物学方法

用于载体构建的DNA 扩增所用的PCR 扩增体系如下：5×buffer 10μL， FastPfu Fly DNA Polymerase 1μL (全式金)，2.5 mmol dNTPs 4μL，DNA 模板 0.5μL (约 5 ng 质粒 DNA)，10μmol 上下游引物各1μL，ddH2O 32.5μL。

以下为PCR 扩增条件：95 ℃ 2 min，35 个循环(95 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 0.5～1 min(根据DNA 片段长度确定)，72 ℃ 5 min。PCR 产物经纯化后，连接到 pEASY 载体。采用1%琼脂糖对PCR产物进行检测。

HPH-GFP融合表达载体的构建采用如下方法进行：分别用TRP-F/HYG-GFP-R和HYG-GFP-F/GFP-T引物对从pBHt 2载体和PYBA 1132载体扩增带有启动子TrpC的潮霉素HPH片段和GFP片段，并以此PCR产物HPH和GFP片段为模版，用TRP-F/GFP-T引物扩增，获得融合的HPH-GFP片段，并将该片段插入全式金pEASY-Blunt克隆载体，挑单克隆DNA测序鉴定没有突变的克隆保存备用(图2)。

1.2.3稻瘟菌原生质体的制备及转化

原生质体制备：将新鲜的固体培养基上的菌丝切成小块，置于液体完全培养基中，28 ℃ 120 r·min-1培养3 d；过滤收集菌丝，用0.7 M NaCl溶液洗涤菌丝去除残余培养基；将菌丝转移至溶菌酶溶液中， 30 ℃ 90 r·min-1裂解3～4 h，镜检原生质体裂解情况，用 1×STC洗剂重悬原生质体至 5 × 107个·mL-1。

原生质体转化：采用40% PEG(PTC)对原生质体进行转化， 200μL原生质体与100μL PCR产物，孵育 20 min；加入PTC 1.5 mL，孵育20 min；最后加入TB 3培养基，28 ℃，90 r·min-1摇床上复苏12 h。

图2 HPH-GFP融合表达载体

表1 引物列表

引物名称 引物序列(5’-3’)TRP-FGCTGGAGCTAGTGGAGGTCAAHYG-GFP-RCTCGCCCTTGCTCACCATTTCCTTTGCCCTCGGACGAGTHYG-GFP-FACTCGTCCGAGGGCAAAGGAAATGGTGAGCAAGGGCGAGGFP-TTCACTTGTACAGCTCGTCCATM13-FTGTAAAACGACGGCCAGTM13-RCAGGAAACAGCTATGACCHY-FGCCGTGGTTGGCTTGTATGFP-RTCGCCGGACACGCTGAAMoNACα_UAAGGAATCTTTGGGACTMoNACα_AFTATCCAATCGGCATTAGGGMoNACα_ARACTGGCCGTCGTTTTACATTTCGCGGGTGGTCAAMoNACα_BFGGTCATAGCTGTTTCCTGACACTCGGTCTTGGTTTATTGMoNACα_BRTGAGGACGGAGCGGTAGMoNACα_NFGACCGCCGTCATCCACTMoNACα_NRTCACCGAAGACGCTGTAATGMoNACα_DBCCTGGCAGTCTCAAT

1.2.4稻瘟菌DNA的提取

采用微量法提取法对稻瘟菌DNA进行提取，方法如下：在1.5 mL离心管中 加入约100μL 金刚砂，加入400μL CTAB提取buffer(CTAB 10 g，Tris 6.06 g，EDTA 1.46 g，NaCl 0.5 g，加水定容到500 mL)，用灭菌的棉签刮取适量菌丝放入管中，加入400μL的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，把离心管置于37 ℃摇床250 r·min-1摇1 h，13 000 r·min-15 min，吸取250μL 上清液，加入800μL 无水乙醇，-20 ℃沉淀30 min，70%乙醇洗1次，室温晾干，加入50μL ddH2O溶解DNA，取1μL进行PCR。

1.2.5引 物

本研究所用引物见表1。

2 结果与分析

本实验包括两轮PCR，其具体操作流程如图3所示。

2.1 第一轮PCR扩增

分别用HYG-GFP-F/GFP-T和TRP-F/HYG-GFP-R引物对从PYBA 1132载体和pBHt 2载体扩增GFP片段(720 bp)和带有启动子TrpC的潮霉素HPH片段(1 352 bp)(图4泳道2和3)。然后用M 13-F/M 13-R引物从HPH-GFP融合表达载体上克隆出HPH-GFP片段，备用(图4泳道4)。分别用基因上、下游片段特异引物AF/AR和BF/BR对基因组DNA进行扩增，其中AR引物和BF引物5’端分别加ACTGGCCGTCGTTTTACA和GGTCATAGCTGTTTCCTG接头序列，得到基因上下游特异片段(图3)。

2.2 第二轮PCR扩增

分别用第一轮PCR所得到的HPH-GFP片段和基因上下游特异片段为模版，以引物AF/GFP-R和HY-F/BR扩增，得到2个上下游片段 HPH-GFP的嵌合体片段，1∶1混合2个片段(图3)，然后用嵌合体片段进行真菌遗传转化。

2.3 稻瘟菌NACα基因敲除

为检验本研究方法的可行性，用本方法对稻瘟菌NACα基因进行敲除，NACα基因序列来自于稻瘟菌数据库(http://fungidb.org/fungidb/)，具体步骤如下：

注：A为转化子PCR鉴定；1,2为泳道为野生型基因组对照；3，4为转化子基因组DNA；5为水对照。B为转化子荧光鉴定。图5 转化子的鉴定

图3 两步PCR法构建基因敲除流程图

注：1为泳道为阴性对照；2为泳道为GFP片段；3为泳道为HPH片段；4为泳道为HPH-GFP片段；M为Marker。图4 HPH-GFP融合片段PCR扩增结果

1) 经过第一轮PCR分别扩增MoNACα基因上下游片段：分别用引物MoNACα_AF/ MoNACα_AR和MoNACα_BF/ MoNACα_BR从稻瘟菌基因组中扩增基因上游片段(595 bp)和下游片段(550 bp)；

2) 第二轮PCR扩增形成MoNACα基因上下游片段与HPH-GFP的嵌合体：分别用从第一轮PCR得到的上下游产物和HPH-GFP片段为模版，以引物AF/GFP-R和HY-F/BR扩增，得到2个上下游片段-HPH-GFP的嵌合体片段，1∶1混合2个片段，备用；

3) 原生质体转化：将混合的片段转入稻瘟菌原生质体进行转化，25 ℃培养1周，挑取转化子进行鉴定。

2.4 转化子鉴定

1) 转化子DNA的PCR验证：用CTAB法提取转化子DNA，并分别用MoNACα_UA/GFP-R、HY-F/ MoNACα_DB和MoNACα_NF/ MoNACα_NR这3对引物扩增提取的转化子DNA来验证是否为阳性转化子。结果显示阳性转化子用MoNACα_UA/GFP-R、HY-F/ MoNACα_DB引物可以扩增出条带(图5第3泳道)，而用引物MoNACα_NF/ MoNACα_NR则不能扩增出条带(图5 A第3泳道)，相反野生型对照用MoNACα_NF/MoNACα_NR可以扩增出条带(图5 A第1,2泳道)，说明第3泳道的转化子为阳性，其MoNACα基因被敲除，而第4泳道的转化子则为未敲除的阴性转化子。

2) 用荧光显微镜观察转化子是否有GFP荧光：为进一步确定是否敲除转化子是否为阳性，用牙签挑取阳性转化子少许菌丝，打散到加水的载玻片上，在荧光显微镜下观察转化子是否有GFP信号，结果显示阳性转化子在荧光显微镜下有GFP信号(图5 B)，用荧光观察的方法与PCR鉴定方法结果一致。由于用荧光鉴定免去了提取真菌DNA复杂繁琐的程序，因而采用本研究进行突变体鉴定更加高效而简单。

3 结论与讨论

随着功能基因组学时代的到来，对基因的功能研究已经变得越来越普遍。在丝状真菌的研究中，通常采用同源重组的方法进行基因敲除，然后采用抗生素等筛选标记对转化子进行筛选，最后采用提取转化子的DNA，用PCR对转化子进行鉴定[8]。转化子鉴定工作复杂而繁琐，对于动辄成百上千个转化子鉴定，一一提取DNA，PCR鉴定费时费力费钱，虽然也有研究报道简化的DNA提取方法，起到了减少工作量的目的，但还远远不能满足快速鉴定的目的。因此，本研究采用GFP荧光标记方法进行检测，使得转化子鉴定工作效率大大提高，同时也减少了酚氯仿等试剂的使用，安全性也大大提高。

有研究采用三轮PCR的方法，形成基因敲除嵌合体转化镰刀菌获得基因敲除突变体[9]，本研究采用两步法PCR的方法进行基因敲除，步骤进一步简化，有利于大规模的基因敲除工作。转化子的筛选通常依赖标记抗生素的筛选，也有报道采用失活聚酮合酶基因的方法作为标记基因(该基因失活后会产生白化现象)[10]，这可以作为今后借鉴的思路。