裂壳菌L-14原生质体制备与再生体系构建

农 倩，张雯龙，谢 玲，廖仕同，覃丽萍

(广西农业科学院微生物研究所，广西 南宁 530007)

【研究意义】裂壳菌(Schizotheciumsp.)作为深色有隔内生真菌(Dark Septate Endophyte, DSE)的一个分类单元[1]，广泛分布于林地[2]、重金属矿区[3]、甘蔗种植区[4]、荒漠[5]和沙地[6]等生态环境的植被中，能定殖于多种植物根系中，形成真菌与根系的共生复合体。随着研究的深入，人们发现极端或特殊生境中的DSE对促进宿主植物生长，提高耐受环境胁迫能力等方面有都发挥着重要作用[7-9]。裂壳菌L-14为本研究组分离自甘蔗根际土壤的一株深色有隔内生真菌，将其接种至甘蔗或香蕉组培苗，能显著提高植株的株高、鲜重或干重，表现出良好的促生效果[10-11]，且接种后的香蕉植株对香蕉枯萎病的防治效果显著[11]，显示出良好的发展应用潜力。对L-14菌株原生质体制备与再生进行研究，对进一步揭示其在植株中的定殖分布规律、阐明其促生和生防作用机理具有重要意义。【前人研究进展】不同真菌的由于生物学特性差异，原生质体的制备与再生条件也有所不同，常用的细胞壁降解酶有崩溃酶、裂解酶、纤维素酶、蜗牛酶和葡聚糖酶等，酶解温度多数为26～30 ℃，酶解时间根据菌株特点差异较大[12-13]，另外稳渗剂的选择也影响原生质体是否易于呈现分散状态[14]的关键因素，一般都需要探索及优化。【本研究切入点】合适的制备条件有利于提高原生质体的形成率，从而提高转化效率，目前有关裂壳菌原生质体制备与再生的最适条件尚未明确。【拟解决的关键问题】通过探讨不同降解酶液浓度组合、酶解时间、酶解温度及渗透压稳定剂种类对裂壳菌原生质体制备的影响，同时筛选适合的原生质体再生培养基，建立高效的裂壳菌原生质体制备和再生体系。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

裂壳菌菌株L-14由本研究组分离保存；PDA培养基：新鲜马铃薯200.0 g、葡萄糖20.0 g、琼脂15.0 g、加水至1 L；YEPG培养基[15]：酵母提取物3.0 g、蛋白胨10.0 g、葡萄糖20.0 g、琼脂粉15.0 g、加水至1 L；PDS培养基：马铃薯200.0 g、蔗糖182.0 g、琼脂8.0 g，加水至1 L；YEPS培养基：酵母提取物3.5 g，蛋白胨5.0 g，蔗糖200.0 g，琼脂粉15.0 g，加水至1 L；崩溃酶、裂解酶、蜗牛酶、纤维素酶购自北京索莱宝科技有限公司；STC溶液含1.2 mol/L山梨醇、50 mmol/L CaCl2、10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)，使用0.22 μm微孔过滤器过滤除去杂质。其它试剂均为国产分析纯。

1.2 菌丝体的制备

取纯化培养的L-14菌株，用接种刀剁成细小菌块接入YEPG培养液中，28 ℃、110 r/min培养7 d后，过滤掉大颗粒菌丝团，收集孢子悬浮液，离心后再次用无菌水悬浮。吸取1 mL悬液至60 mL YEPG培养液中，28 ℃、10 r/min培养，待看到明显菌丝后，过滤收集菌丝体，并用灭菌的0.7 mol/L NaCl溶液冲洗3次，灭菌滤纸吸干水分。

1.3 原生质体的制备

取上述收集的菌丝体200 mg加入2 mL裂解液中，30 ℃、80 r/min裂解4.0 h，用3层灭菌擦镜纸过滤，滤液4 ℃、4000 r/min离心10 min，取沉淀加入10 mL STC溶液，4 ℃、4000 r/min离心10 min，弃上清液，沉淀用STC溶液调整浓度为1×106个/mL，分装保存在-80 ℃冰箱待用。

1.4 酶解液种类对原生质体产量的影响

以预冷的灭菌0.7 mol/L NaCl溶液配制不同酶解液组合，常温70 r/min溶解30 min，经0.22 μm微孔过滤器过滤灭菌(表1)。采用1.3方法进行菌丝裂解，并于裂解开始后，每隔30 min用血球计数板镜检计数原生质体，计算产量，每处理重复3次。

1.5 酶解温度和渗透压稳定剂对原生质体产量的影响

采用0.7 mol/L的NaCl为渗透压稳渗剂，以1.4中获得的最优酶解液组合分别在25、30、35和40 ℃下，80 r/min酶解5.0 h，计数不同处理原生质体的产量；在最优酶解液组合和酶解温度下，分别以0.7 mol/L的NaCl、KCl、山梨醇和蔗糖作为渗透压稳定剂，80 r/min酶解5.0 h后计数不同处理原生质体的产量，每处理3次重复。

1.6 原生质体的再生

取1×104个/mL的原生质体200 μl，分涂布在PDA、YEPG、1和2号再生培养基平板上，28 ℃培养箱中培养7 d，记录单菌落生长数量。原生质体再生率=(固体培养基上小菌落数量-对照小菌落数量)/原生质体数量×100 %。采用DPS软件以Duncan’s新复极差法(P≤0.05)进行各处理平均数差异显著性检验。

表1 不同酶解液的组分Table 1 The enzyme combinations

2 结果与分析

2.1 不同酶液组合对原生质体产量的影响

由图1可知，不同种类的细胞壁降解酶对原生质体产量释放效果不同，混合酶液(组合3、4)的酶解效率高于单一类酶(组合1、2)。酶解5.0 h后，不同组合降解所得原生质体数量之间均存在显著差异，其中组合1降解所得的原生质体数量为11.90×105个/mL，显著高于组合2；组合4原生质体产量显著高于上述2种单一酶类，组合3原生质体产量最多，达19.73×105个/mL，显著高于其他组合。

2.2 不同酶解时间对原生质体产量的影响

随着酶解时间增加，各组合酶液的原生质体产量均呈现先增加后减少趋势(图2)，其中组合1、组合2和组合3的最优酶解时间为5.5 h，此时各组合原生质体产量分别为13.07×105、10.73×105和20.87×105个/mL，组合酶液组合4在酶解4.5 h时已达到原生质体最大产量15.77×105个/mL。

不同小写字母表示在0.05水平上差异显著，下同Different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level, the same as below图1 不同降解酶组合对裂壳菌原生质体数量的影响Fig.1 Influences of different enzyme combinations on the protoplast release of Schizothecium sp.

图2 不同酶解时间对原生质体产量的影响Fig.2 Effects of different enzymatic time on the yield of protoplast

2.3 不同酶解温度对原生质体产量的影响

以组合3进行酶解时发现，在30 ℃、80 r/min条件下酶解5.0 h获得的原生质体数量最高，达20.10×105个/mL，与其他温度处理间差异显著(图3)。

2.4 不同渗透压稳定剂对原生质体产量的影响

4种渗透压稳定剂配制的酶液获得的原生质体产量各不相同(图4)。通过显微镜计数发现，利用无机溶剂(NaCl、KCl)作为渗透压稳定剂时原生质体较为分散，而有机溶剂(山梨醇、蔗糖)制备的原生质体易聚集成团，其中采用0.7 mol/L的NaCl作为渗透压稳定剂获得原生质体数量最多，达到18.43×105个/mL，比其他处理显著增加。

2.5 不同培养基对原生质体再生率的影响

菌株L-14的原生质体在显微镜下呈透明圆球状，直径约2～5 μm(图5A)。将原生质体涂布在PDA、PDS、YEPG和YEPS培养基上，均能生长出菌落(图5B)，其中YEPG和YEPS培养基上的菌丝颜色稍浅。通过计数菌落数发现，利用PDS培养基的原生质体再生率可达10.65 %，显著高于其它类型培养基(图6)。

图3 不同酶解温度对原生质体产量的影响Fig.3 Effects of different enzymatic temperature on the yield of protoplast

图4 渗透压稳定剂对原生质体产量的影响Fig.4 Effects of different osmotic stabilizer on the yield of protoplast

图5 裂壳菌L-14原生质体形态及其再生菌落Fig.5 The protoplast and regeneration colony of Schizothecium sp. L-14

3 讨 论

真菌原生质体制备过程包含细胞壁的酶解与原生质体内外渗透压平衡两个关键环节，而不同真菌细胞壁构成存在差异，在酶液选择上也各有不同。沈慧敏等[14, 16]研究发现采用崩溃酶+裂解酶+蜗牛酶组合酶解小麦光腥黑粉菌及小麦矮腥黑粉菌时，获得的原生质体产量最高，陈亮等[17]采用崩溃酶+裂解酶进行苹果烂腐病菌原生质体制备也取得良好的效果。本研究通过比较不同的酶液组合对裂壳菌L-14原生质体产量的影响，发现崩溃酶比裂解酶获得的原生质体数量多，表明崩溃酶对裂壳菌的细胞壁降解作用更显著；崩溃酶+裂解酶混合进行细胞壁酶解比使用单一酶类效果要好，这可能是不同酶在作用时产生协同效应，提高了细胞壁的降解效率；崩溃酶+裂解酶+蜗牛酶组合降解细胞壁时，原生质体产量低于崩溃酶+裂解酶组合，猜测酶成分过高时会对原生质膜产生一定损伤，导致原生质体的破碎解离，表明并非酶成分越丰富酶解效果越显著。

研究发现，制备真菌原生质体时，随着酶解时间增加，原生质体数量会呈现先增加后减少的趋势[16-17]，本试验结果与前人研究基本一致。原生质体达到最大产量后下降的原因可能是酶液随着作用时间变长而活力降低，新释放的原生质体数量少于自身破碎解离的量所导致。另外，本研究中崩溃酶+裂解酶+蜗牛酶组合在酶解4.5 h后达到原生质体最大产量，时间比最佳酶组合(崩溃酶+裂解酶)快1.0 h，但随后原生质体数量急剧减少，酶解7.0 h后，原生质体仅有7.43×105个/mL，数量显著低于最佳酶组合，表明该酶组合可能对原生质膜存在一定破坏作用，不利于原生质体的保存。

渗透压稳定剂是原生质体维持膜内外压力平衡、保持活力的重要介质，本研究发现利用无机溶剂作为渗透压稳定剂时原生质体较为分散，而有机溶剂制备的原生质体易聚集成团，与沈慧敏等[14, 16]的研究结果一致。另外也有报道采用无机溶剂与有机溶剂相混合作为稳渗剂，并获得高质量原生质体[18]，上述方法是否适用于裂壳菌原生质体的制备保存有待进一步的验证。已报道的用于真菌原生质体再生的培养基配方种类较多，本研究发现PDS配方较利于裂壳菌原生质体的再生，获得的再生率显著高于其它类型培养基，前人的研究发现该配方亦适用于苹果烂腐病菌[17]及木霉[19]等真菌的原生质体再生。

图6 不同培养基上的原生质体再生率Fig.6 The regeneration rate of protoplast in different medium

4 结 论

初步构建了裂壳菌L-14原生质体制备和再生体系：菌株经YEPG液体培养基培养7 d后，使用0.7 mol/L的NaCl作为渗透压稳定剂配置浓度各为20 mg/mL的崩溃酶+裂解酶复合酶液，在30 ℃、80 r/min酶解5.5 h后可获得较好的原生质体数量，使用PDS培养基较利于裂壳菌原生质体的再生。