番茄匍柄霉原生质体的制备与再生体系构建

龚伟杰，刘 洪，黄 萍，王 慧，周 倩

(湖南农业大学 植物保护学院,植物病虫害生物学与防控湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128)

番茄匍柄霉()是一类世界性分布的重要植物病原物，可引起多种蔬菜病害，降低蔬菜产量和品质，给菜农造成巨大经济损失。为深入研究番茄匍柄霉的致病机制与功能基因组学，需建立高效、稳定的遗传转化体系。PEG介导的原生质体遗传转化是最常用的转化方法，其前提是制备大量可再生的原生质体。目前很多病原真菌均已建立了成熟的PEG介导的原生质体遗传转化体系，包括稻瘟病菌、枯萎病菌、纹枯病菌、黑粉病菌、苹果腐烂病菌等，但有关番茄匍柄霉的遗传转化体系仍未见报道。原生质体是通过酶裂解细胞壁获得的裸露细胞，仅含一层质膜为隔绝外界的唯一屏障，对外界环境的变化极为敏感。原生质体制备与转化体系现已被广泛用于生理、生化、遗传、分子生物学、基因组学、蛋白质组学、代谢组学研究。由于真菌的不同种属甚至不同专化型菌株间生物学特性的不同，其制备原生质体的方法和条件也不尽相同，因此，筛选并优化制备原生质体的条件，建立番茄匍柄霉有效的原生质体制备与再生体系对研究番茄匍柄霉致病机理和功能基因组学至关重要。本研究通过探讨菌龄、酶种类与浓度、酶组合、酶解温度与时间、渗透压稳定剂对原生质体制备的影响，以及原生质体在不同培养基中的再生率，建立了高效的番茄匍柄霉原生质体制备和再生体系，为今后番茄匍柄霉的相关研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株

番茄匍柄霉菌株CS12由本实验室分离保存。

1.1.2 培养基

PDA培养基：去皮马铃薯200 g，琼脂20 g，葡萄糖20 g，去离子水定容至1 L；不加琼脂为液体培养基。TB3培养基：酪蛋白水解物3 g，酵母提取物3 g，蔗糖200 g，琼脂15 g，去离子水定容至1 L；不加琼脂为液体培养基。YEPG培养基：酵母提取物3 g，蛋白胨10 g，葡萄糖20 g，琼脂粉15 g，加水至1 L；YEPS培养基：酵母提取物3.5 g，蛋白胨5.0 g，蔗糖200.0 g，琼脂粉15.0 g，加水至1 L。

1.1.3 试剂

裂解酶(Kitalase)、溶壁酶(lysing enzymes)、蜗牛酶(snailase)、崩溃酶(driselase)购自美国Sigma公司。STC溶液：含1.2 mol·L山梨醇、10 mmol·LpH值7.5的Tris-HCl、50 mmol·LCaCl。酶解液：用预冷的0.7mol·LNaCl溶液配制，轻微摇晃混匀，0.22 μm细菌过滤器过滤。

1.2 试验方法

1.2.1 原生质体的制备

将活化的CS12菌株接种于PDA中，于28 ℃、180 r·min摇床中培养，待长出菌丝后，用灭菌研钵研磨菌丝至不见明显菌丝球，重新接种于新PDA中培养12～48 h，用灭菌纱布过滤，收集菌丝，用0.7 mol·LNaCl冲洗去除PDA，将菌丝置于5 mL酶解液中，28 ℃，80 r·min振荡，每隔30 min镜检1次，酶解结束用无菌擦镜纸过滤，稳渗剂冲洗擦镜纸15～20次，4 000×g离心滤液4～5 min，然后用移液枪吸去上清液，加入200 μL STC溶液重悬原生质体，镜检。

1.2.2 稳渗剂对原生质体制备的影响

用0.7 mol·LMgSO、1.2 mol·LMgSO、0.7 mol·LNaCl和1.2 mol·LNaCl溶液分别作为稳渗剂，分别配置酶解液，试验设置3次重复，用血球计数板统计原生质体数量。

1.2.3 酶对原生质体制备的影响

采用上述试验筛选的最佳稳渗剂，选择菌龄为12 h的幼嫩菌丝，28 ℃酶解3 h，Kitalase裂解酶、溶壁酶、蜗牛酶、崩溃酶均配置5、10、15、20、25 mg·mL，用于酶解制备原生质体。试验设置3次重复，用血球计数板测量原生质体数量。

1.2.4 不同酶组合对原生质体制备的影响

采用酶解效率最高的浓度进行组合，其中2种酶组合、3种酶组合、4种酶组合，共11种组合处理方式。稳渗剂采用0.7 mol·L的NaCl，试验设置3次重复，用血球计数板统计原生质体数量。

1.2.5 菌龄对原生质体制备的影响

采用酶解效率最佳组合对12、18、24、30、36、42、48 h菌龄的菌丝进行酶解，酶解时间为3 h，稳渗剂采用0.7 mol·L的NaCl，试验设置3次重复，用血球计数板统计原生质体数量。

1.2.6 酶解温度对原生质体制备的影响

采用上述试验中筛选的最佳条件分别在24、26、28、30、32 ℃进行酶解，酶解时间为3 h，稳渗剂采用0.7 mol·L的NaCl，试验设置3次重复，用血球计数板测量原生质体数量。

1.2.7 酶解时间对原生质体制备的影响

采用上述试验中最佳条件，稳渗剂采用0.7 mol·L的NaCl，分别酶解2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h。试验设置3次重复，用血球计数板测量原生质体数量。

1.2.8 不同培养基对原生质体再生的影响

取100 μL原生质体悬液轻轻涂布在PDA、YEPG、YEPS、TB3培养基上，试验设置3次重复，28 ℃培养箱中培养3～4 d，记录单菌落生长数量。显微镜下用血球计数板统计原生质体悬液中的原生质体数量()；菌落长出后统计平板菌落数()。

1.3 数据分析

利用SPSS19.0软件进行数据统计分析，采用LSD法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同渗透压缓冲液对原生质体制备的影响

原生质体对渗透压较为敏感，浓度适宜的稳渗剂有助于原生质体的释放，以及维持原生质体状态的稳定，使其不易破裂。由图1可知，NaCl效果比MgSO好，0.7 mol·LNaCl的效果更佳。因此，番茄匍柄霉原生质体制备推荐采用0.7 mol·LNaCl作为稳渗剂。

图1 稳渗剂对原生质体制备的影响

2.2 酶对原生质体制备的影响

由于不同真菌的细胞壁组成成分不同，酶的种类直接影响原生质体的释放效率。由图2可知，不同酶组合的酶解效率差异较大，其中，Kitalase裂解酶在浓度为10 mg·mL时产量最高，原生质体数量达8.72×10mL，其效率明显高于其他3种酶；蜗牛酶的效率最低，原生质体数量最高为0.52×10mL。

图2 酶种类与浓度对原生质体制备的影响

2.3 不同酶组合对原生质体制备的影响

为了筛选最佳的酶组合，将单个酶的最佳浓度(Kitalase裂解酶10 mg·mL，溶壁酶10 mg·mL，崩溃酶25 mg·mL，蜗牛酶10 mg·mL)进行不同的组合试验，观察其释放原生质体的情况。结果如图3所示，4种酶组合效果最佳，其原生质体的产量最高可达到9.25×10mL，但酶解效率与单独使用10 mg·mLKitalase裂解酶(8.72×10mL)没有显著差异。

Kit，Kitalase裂解酶；Lys，溶壁酶；Dri，崩溃酶；Sna，蜗牛酶。

从节约成本的角度考虑，推荐制备番茄匍柄霉原生质体采用10 mg·mLKitalase裂解酶。

2.4 菌龄对原生质体制备的影响

菌丝的菌龄对原生质体的制备影响很大，不同菌龄的菌丝细胞壁组成不同，对酶的敏感程度也不同，幼嫩菌丝的细胞壁易被酶解，但幼嫩菌丝产生的原生质体往往不稳定，容易破裂，因此需要摸索最佳菌龄。试验结果表明，开始随着菌龄的增加，原生质体的产量不断增加，当菌龄到36 h时，原生质体产量达到最高，此后原生质体产量随着菌龄的增加逐渐下降(图4)。因此，番茄匍柄霉制备原生质体菌丝的最佳培养时间为36 h。

图4 不同菌龄对原生质体制备的影响

2.5 酶解温度对原生质体制备的影响

不同酶解温度也能显著影响原生质体的制备，在其他条件相同的情况下，将酶解温度分别设为24、26、28、30、32 ℃。试验结果(图5)表明，原生质体产量随着温度的升高而增加，28 ℃时效果最佳，之后随着温度的升高原生质体的产量逐渐降低。

图5 不同酶解温度对原生质体制备的影响

2.6 酶解时间对原生质体制备的影响

在其他条件一致的情况下，将酶解时间分别设为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h。原生质体产量最初随着酶解时间的延长而增加，酶解3.0 h后增长变缓，酶解3.5 h产量达到最高，之后随着时间的延长，原生质体的产量开始下降(图6)。酶解时间过短，菌丝酶解不完全，原生质体释放不彻底，而酶解时间过长，原生质体失去细胞壁保护后不稳定，长时间暴露在酶解液中，酶解液中的杂质蛋白酶对原生质体膜造成损害而导致原生质体破裂。因此，番茄匍柄霉最佳的酶解时间为3.5 h。

图6 不同酶解时间对原生质体制备的影响

2.7 培养基对原生质体再生的影响

菌株CS12的原生质体在显微镜下呈透明圆球状(图7)。取100 μL原生质体分别涂布在PDA、YEPG、YEPS、TB3培养基上，均能生长出单菌落。通过菌落计数发现，利用YEPS培养基的原生质体再生率可达10.80%，显著高于其他类型培养基(图8)。

图7 番茄匍柄霉CS12的原生质体形态

图8 不同培养基上的原生质体再生率

3 讨论

原生质体制备与再生体系的建立是进行分子遗传学操作的基础和前提，关于真菌原生质体制备与再生的研究报道较多，但由于真菌种类繁多，其细胞壁结构复杂，组成成分多样，原生质体制备条件不尽相同；因此，优化原生质体制备与再生条件尤为重要。在尝试利用PEG介导的原生质体转化研究番茄匍柄霉基因功能时，首先参照了王琪制备葱叶匍柄霉原生质体的条件，发现15 mg·mL溶壁酶、10 mg·mLLywallzyme裂解酶、10 mg·mL蜗牛酶和5 mg·mL纤维素酶(cellulase)组合，30 ℃酶解培养菌龄36 h的菌丝3.5 h，番茄匍柄霉原生质体的释放效率不高。说明同属不同种的匍柄霉菌株之间，细胞壁成分存在较大差别，因此，需要探索适合番茄匍柄霉的酶解条件。Kitalase裂解酶对链格孢属酶解效率显著高于其他常规裂解酶，而匍柄霉属和链格孢属亲缘关系较近。本试验在摸索酶解条件时加入了Kitalase裂解酶，发现在单酶酶解试验中，10 mg·mLKitalase裂解酶酶解效果最好，释放的原生质体数量最多，增加溶壁酶、蜗牛酶和崩溃酶不能显著提高酶解效率；因此，推荐用10 mg·mLKitalase裂解酶酶解番茄匍柄霉制备原生质体。Kitalase裂解酶最早报道来源于，是一种内切β-1，3-葡聚糖酶。真菌细胞壁中广泛存在葡聚糖，其中1，3-β-D-葡聚糖占真菌细胞壁成分50%以上，Kitalase裂解酶可催化1，3-β-D-葡聚糖水解。推测番茄匍柄霉细胞壁中1，3-β-D-葡聚糖含量高，因此Kitalase酶解效果好。

稳渗剂可维持原生质体细胞膜内外渗透压平衡，也会影响酶的活性。制备丝状真菌原生质体时，选择的稳渗剂一般为无机盐类，如NaCl、MgSO等。酶解过程中释放的原生质体失去细胞壁的保护后容易破裂，而合适的稳渗剂会对原生质体产生保护作用，因此，稳渗剂的选择至关重要。本试验对不同浓度的NaCl和MgSO进行筛选，最终发现0.7 mol·LNaCl溶液作为稳渗剂时效果最好。

用于原生质体再生的培养基种类很多，本试验比较PDA、YEPG、YEPS、TB3培养基的再生效果，发现YEPS培养基再生效果最好，可能是因为YEPS培养基富含碳源、氮源，利于番茄匍柄霉的再生。

本研究通过单因素试验优化了菌龄、酶种类与浓度、酶组合、酶解温度和时间、渗透压稳定剂，并比较了不同再生培养基的再生效率，成功建立了番茄匍柄霉的高效原生质体制备与再生体系，为探索番茄匍柄霉基因功能提供了技术保障。

4 结论

本研究从菌龄、酶种类与浓度、酶组合、酶解温度与时间、不同渗透压稳定剂等方面对番茄匍柄霉原生质体制备条件进行优化，明确原生质体制备的最佳条件如下：菌龄为36 h，稳渗剂为0.7 mol·LNaCl溶液，酶解液10 mg·mLKitalase裂解酶，28 ℃酶解3.5 h，制备原生质体效果最佳；番茄匍柄霉原生质体在YEPS培养基上再生效率最高。