丙泊酚调控miR-133a/SOX4表达对结直肠癌HCT116细胞增殖凋亡的影响

韩俊 赵静 张立群

结直肠癌是一种发病率和死亡率均较高的消化道恶性肿瘤，手术根治性切除目前仍是其治疗的重要手段，而麻醉是手术过程中的重要部分，作为常用的静脉注射麻醉药——丙泊酚是否影响着肿瘤的发生发展逐渐引起人们的关注［1］。随着研究的深入，除了对中枢神经系统起到催眠和镇静作用外，丙泊酚在食管癌、胃癌和胶质瘤等肿瘤治疗过程中还表现出较好的抑瘤作用［2-4］。已有研究证实丙泊酚可通过抑制癌细胞增殖和促进凋亡的途径抑制结直肠癌的恶性进展，但具体的作用机制尚不完全清晰［5-6］。miR-133a 是一种与肿瘤发生发展关系密切的小分子RNA，被证实在结直肠癌中低表达，而上调其表达可抑制肿瘤细胞增殖和转移，并诱导细胞凋亡［7-8］。有研究发现，丙泊酚可通过上调miR-133a 的表达抑制胰腺癌细胞的增殖和转移，但其是否通过影响miR-133a 表达参与调控结直肠癌增殖凋亡的分子机制并不清楚［9］。因此，本研究以结直肠癌HCT116 细胞为研究对象，观察丙泊酚对HCT116 细胞增殖凋亡的影响，探讨其对miR-133a表达的调控，为进一步阐明丙泊酚改善结直肠癌恶性进展的分子机制提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂与仪器

人结直肠癌HCT116 细胞株购于美国模式培养物集存库（American Type Culture Collection，ATCC），RPMI-1640 培养基和胰蛋白酶购于美国Hyclone 公司，胎牛血清购于美国Gibco 公司，脂质体2000 和Trizol 试剂购于美国Invitrogen 公司。二甲基亚枫、丙泊酚和噻唑蓝（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）试剂美国Sigma-Aldrich 公司，聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜购于美国GE Health care Life Science 公司，增 强 化 学 发 光（enhancedchemiluminescence，ECL）检测试剂盒购于美国GE health care 公司，miR-133a inhibitor（货号：miR3012）、miR-133a mimics（货号：miR1008）及其相应的阴性对照购于广州锐博生物科技有限公司。性别决定基因相关HMG 盒基因4（SRY-related HMG-box4，SOX4）抗体（货号：A-ABV10137）购于艾美捷科技有限公司，甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体（货号：2218）购于美国Cell signaling 公司。青霉素-链霉素、膜联蛋白V-FITC（annexin V-FITC）/碘化丙啶（propidium Iodide，PI）细胞凋亡检测试剂盒购于上海碧云天生物公司。双荧光素酶报告基因检测试剂盒购于北京百奥莱博公司。恒温CO2细胞培养箱购于日本三洋公司，7900HT real-time PCR 仪购于美国应用生物系统公司，DYC-31D 型电泳仪购于北京六一仪器厂，CEL-DOC2000 型紫外凝胶成像3 系统购于美国Bio-Rab 公司。流式细胞仪购于美国BD Biosciences 公司。

1.2 HCT116 细胞培养

将液氮中装有HCT116 细胞的冻存管置于温水浴中快速溶解后，转移至离心管中，加入RPMI-1640 培养基吹打混匀。以1 000 rpm 离心5 min，弃上清后以含有10%胎牛血清的RPMI-1640 培养基重悬细胞。以25 cm2的培养瓶接种细胞，并放置于5% CO2、饱和湿度的37℃恒温细胞培养箱内培养。待细胞铺满瓶底80%以上时，加入0.25%胰蛋白酶消化，并按照1∶3 比例传代。实验所有HCT116 细胞均处于对数生长期。

1.3 MTT 法测定HCT116 细胞增殖情况

每孔200 μL HCT116 细胞悬液（含30 000 个细胞）接种于96 孔细胞板上。培养箱内培养过夜后，给予浓度为0、1、5 和10 μg/mL 丙泊酚，每孔设置4 个复孔。培养箱内孵育24、48 和72 h 后，以MTT 法检测细胞在λ=570 nm 处的吸光度OD 值，具体方法参照文献［2］。

1.4 流式细胞仪测定HCT116 细胞凋亡情况

详细步骤参照文献［6］，实验重复测定3 次。

1.5 real-time PCR 测定HCT116 细胞中miR-133a的表达情况

采用Trizol 法提取HCT116 细胞的总RNA，参照逆转录试剂盒说明书将RNA 逆转录成cDNA，以cDNA 为模板按照94℃30 s，94℃5 s、58℃30 s，共38 个循环进行PCR 扩增。其中，由上海吉凯生物公司合成的PCR 引物如下：miR-133a F：5′-CTGCATTGGTCCCCTTCAAC- 3′ 和R：5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3′；U6 F：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA - 3′ 和 R：5′ - AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.6 Western blot 测定HCT116 细胞中SOX4 蛋白的表达情况

详细步骤参照文献［6］，其中SOX4 抗体和GAPDH 抗体工作液以1∶500 稀释，而二抗工作液是按1∶2 000 稀释。实验重复测定3 次。

1.7 HCT116 细胞转染与分组

将HCT116 细胞以每孔20 000 个细胞接种至6 孔细胞板上，放入细胞培养箱内培养过夜。待细胞融合度在70%以上时，参照脂质体2000 说明书步骤将50 nM miR-133a inhibitor 及其阴性对照转染至HCT116 细胞中。转染6 h 更换新鲜培养液进行培养24 h。miR-133a 低表达影响HCT116 细胞实验：随机分为对照组（未做任何处理）、丙泊酚组（给予浓度为10 μg/mL 丙泊酚作用48 h）、丙泊酚+anti-miR-133a 组（转染miR-133a inhibitor 后给予10 μg/mL 丙泊酚作用48 h）和丙泊酚+ anti-miRNC 组（转染miR-133a inhibitor 阴性对照后给予10 μg/mL 丙泊酚作用48 h）。给药处理结束后，收集各组细胞，采用real-time PCR 测定miR-133a 的表达，Western blot 测定SOX4 蛋白的表达，MTT 法和流式细胞仪分别检测各组细胞的增殖和凋亡情况。

1.8 双荧光素酶报告基因实验测定miR-133a 与SOX4 的靶向关系

构建野生型（SOX4-WT）和突变型（SOX4-MUT）的SOX4 的3′-UTR 荧光素酶报告载体。将HCT116 细胞以每孔20 000 个细胞接种至24 孔细胞板上，细胞培养箱内贴壁培养过夜。将其分为miR-133a+SOX4-MUT 组（共转染miR-133a mimics和SOX4-MUT 质粒）、miR-133a + SOX4-WT 组（共转染miR-133a mimics 和SOX4-WT 质粒）、NC+SOX4-MUT（共转染miR-133a mimics 阴性对照和SOX4-MUT 质粒）、NC+SOX4-WT 组（共转染miR-133a mimics 阴性对照和SOX4-WT 组）。根据上述分组参照脂质体2000 转染试剂说明书步骤将miR-133a mimics 及其阴性对照分别与SOX4-MUT质粒、SOX4-WT 质粒共转染至HCT116 细胞中。转染48 h 后，收集各组细胞参照试剂盒说明书步骤检测各组细胞的荧光素酶活性。实验重复检测3 次。

1.9 统计学分析

采用SPSS 22.0 进行统计学分析，计数资料以x±s形式表示，3 组组间数据采用单因素方差分析，方差齐性采用LSD检验，2 组组间采用独立样本t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 丙泊酚抑制HCT116 细胞增殖并促进凋亡

与对照（0 μg/mL）相比，1 μg/mL 异丙酚对HCT116 细胞增殖无显著影响（P＞0.05），但5 μg/mL异丙酚从48 h 开始抑制HCT116 细胞增殖，10 μg/mL 异丙酚从24 h 开始抑制HCT116 细胞增殖（P＜0.05）；丙泊酚对HCT116 细胞增殖有显著的抑制作用，且呈浓度-时间依赖性，结果见图1A。同时，与0 μg/mL 相比，5 μg/mL 和10 μg/mL 丙泊酚能够呈浓度依赖性诱导HCT116 细胞凋亡（P＜0.05），而1 μg/mL 异丙酚对HCT116 细胞凋亡无明显影响。见图1B 和C。

2.2 丙泊酚促进HCT116 细胞中miR-133a 表达而抑制SOX4 蛋白表达

与0 μg/mL 相比，5 μg/mL 和10 μg/mL 丙泊酚显著促进HCT116 细胞中miR-133a（P＜0.05），且呈浓度依赖性；而1 μg/mL 丙泊酚对miR-133a 表达无显著影响（P＞0.05），结果见图2A。同时，5 μg/mL 和10 μg/mL 丙泊酚处理后HCT116 细胞中SOX4 蛋白的表达较0 μg/mL 明显降低（P＜0.05），而以1 μg/mL丙泊酚处理后SOX4 蛋白的表达与0 μg/mL 处理组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2B和C。

图1 丙泊酚对HCT116 细胞增殖凋亡的影响Figure 1 Effects of propofol on proliferation and apoptosis of HCT116 cells

2.3 SOX4 是miR-133a 的靶基因

图2 丙泊酚对HCT116 细胞中miR-133a 和SOX4蛋白表达的影响Figure 2 Effects of propofol on the expression of miR-133a and SOX4 protein in HCT116 cells

采用TargetScan 软件预测发现miR-133a 与SOX4 3′UTR 存在互补结合位点，结果见图3A；与SOX4-WT 共转染的miR-133a 组细胞的荧光素酶活性较NC 组明显降低（P＜0.05），而与SOX4-MUT共转染的miR-133a 组和NC 组之间荧光素酶活性差异无统计学意义（P＞0.05），结果见图3B。

2.4 miR-133a 低表达逆转丙泊酚对HCT116 细胞中SOX4 蛋白表达的抑制作用

与对照组相比，丙泊酚组、丙泊酚+anti-miRNC 组和丙泊酚+anti-miR-133a 组细胞中miR-133a表达显著升高（P＜0.05）；与丙泊酚组相比，丙泊酚+anti-miR-133a 组细胞中miR-133a 表达水平显著降低（P＜0.05），而丙泊酚+anti-miR-NC 组和丙泊酚组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见图4A。同时，丙泊酚组、丙泊酚+anti-miR-NC 组和丙泊酚+anti-miR-133a 组细胞中SOX4 蛋白的表达水平较对照组明显降低（P＜0.05），且丙泊酚+anti-miR-133a 组高于丙泊酚组（P＜0.05）。结果见图4B 和C。

图3 miR-133a 与SOX4 靶向关系的验证结果Figuer 3 Verification of the targeting relationship between miR-133a and SOX4

2.5 miR-133a 低表达逆转丙泊酚对结直肠癌细胞增殖和凋亡的调控作用

与对照组相比，丙泊酚处理下HCT116 细胞增殖能力显著受到抑制（P＜0.05）；与丙泊酚组相比，丙泊酚+anti-miR-133a 组细胞的增殖能力显著增强（P＜0.05）；而丙泊酚+anti-miR-NC 组与丙泊酚组比较无显著差异（P＞0.05）。结果见图5A。同时，丙泊酚组细胞凋亡能力较对照组显著增强（P＜0.05），但丙泊酚+anti-miR-133a 组细胞凋亡能力较丙泊酚组显著减弱（P＜0.05），而丙泊酚+anti-miR-NC 组与丙泊酚组相比无显著变化（P＞0.05）。见图5B 和C。

3 讨论

图4 miR-133a 低表达对丙泊酚作用下HCT116 细胞中SOX4 蛋白表达的影响Figure 4 Effect of low expression of miR-133a on SOX4 expression in HCT116 cells induced by propofol

丙泊酚是一种常用的静脉注射麻醉药，在肿瘤手术过程中的作用不容忽视。随着研究的深入，越来越多的证据显示，丙泊酚在改善肿瘤患者预后和延长生存期方面具有积极作用［10-12］。Yang等［13］和Xing 等［14］发现，低浓度的丙泊酚能够降低脂多糖诱导的HIF-1α、ROS 上调，改善肿瘤微环境，抑制上皮间充质转化和细胞侵袭、迁移；另外，还可通过ERK1/2 途径上调PUMA 表达抑制癌细胞活性和诱导凋亡，进而抑制非小细胞肺癌的恶性进展。Yu 等［15］研究发现低浓度的丙泊酚可通过抑制miR-24/p27 信号通路诱导乳腺癌MDA-MB-435 细胞凋亡；Peng 等［16］报道显示，丙泊酚可通过上调miR-451 影响MMP-2 的表达抑制胃癌SGC-7901 细胞的增殖和加速凋亡。可见，低浓度的丙泊酚可通过复杂多样的分子机制在抑制肿瘤的发生发展过程中发挥着一定的积极作用。

图5 miR-133a 低表达对丙泊酚作用下HCT116 细胞增殖凋亡的影响Figure 5 Effect of low expression of miR-133a on proliferation and apoptosis of HCT116 cells induced by propofol

目前，丙泊酚在结直肠癌中的研究已有报道。例如：余海燕等［5］研究得到的丙泊酚能够抑制结直肠癌LoVo 细胞和诱导细胞凋亡。本研究在结直肠癌HCT116 细胞中进一步验证了上述结果。根据上述资料显示，丙泊酚可通过调控miRNAs如miR-451 和miR-24 等参与其抑肿瘤机制。miRNAs 是一类短小的内源性非编码RNA，可通过与靶mRNAs 的3’UTR 结合在转录后水平上抑制靶基因表达，参与细胞增殖、转移和凋亡等多种生物学过程。miR-133a 是一种与肿瘤发生发展密切相关的miRNA，被证实在胃癌、乳腺癌和非小细胞肺癌等多种肿瘤中异常低表达，而其过表达可通过调控相关靶基因如USP39和LASP1等发挥抑制癌细胞增殖和增强细胞凋亡的作用［17-19］；既往研究证实miR-133a 在结直肠癌的发生发展过程中发挥着重要作用；miR-133a 在结直肠癌中低表达，且扮演着肿瘤抑制因子的角色［7］。本研究发现，丙泊酚能够促进HCT116 细胞中miR-133a 的表达。该结果与Wang 等［6］在胰腺癌的研究中发现的丙泊酚可通过上调miR-133a 表达的结果相吻合。结果提示，miR-133a 可能参与丙泊酚调控结直肠癌增殖和凋亡的分子机制。

SOX4 是SOX 转录因子家族中的重要成员，在多种肿瘤组织或细胞中异常高表达，而干扰其表达可抑制肿瘤细胞的增殖并促进细胞凋亡［20］。既往研究证实SOX4 也在结直肠癌的发生发展过程中发挥着重要作用；靶向抑制异常高表达的SOX4 可抑制结直肠癌细胞的增殖和体外侵袭［21］。本研究还发现，丙泊酚能够抑制HCT116 细胞中SOX4 的表达。该结果与Du等［22］在子宫内膜癌的研究中发现的丙泊酚可抑制SOX4 的表达的结果相一致。这提示SOX4 可能在丙泊酚调控结直肠癌增殖和凋亡过程中扮演着重要角色。

另外，本研究通过生物信息学软件预测发现miR-133a 与SOX4 3′ UTR 存在互补结合位点，双荧光素酶报告基因实验证实SOX4是miR-133a 的靶基因。这与Li 等［23］在食管癌的研究中证实SOX4是miR-133a 的靶基因的结果相吻合。本研究通过转染miR-133a inhibitor 成功下调miR-133a表达后进一步检测发现，miR-133a 低表达可逆转丙泊酚对HCT116 细胞增殖和SOX4 蛋白表达的抑制作用以及对HCT116 细胞凋亡的促进作用。结果提示，丙泊酚可通过上调miR-133a 进而抑制其靶基因SOX4的表达发挥抑制HCT116 细胞增殖和促进细胞凋亡的作用。

综上所述，丙泊酚可通过调控miR-133a/SOX4表达抑制结直肠癌HCT116 细胞增殖和促进癌细胞凋亡。该结果为丙泊酚在结直肠癌手术过程中发挥着积极作用提供新的实验依据，也为其有望成为结直肠癌手术治疗中的理想麻醉药提供新的参考依据。