B群链球菌CAMP阴性株的表型及分子特征初步分析

邓颖颖 孔银波 姜长宏 邓间开 江凌晓★

B 群链球菌（group BStreptococcus，GBS）又名无乳链球菌（Streptococcus agalactiae），是一种革兰氏阳性链球菌。GBS 不仅可正常定植于人体胃肠道及阴道，而且还是新生儿败血症、肺炎、脑膜炎 的重 要 致病 菌［1］。CAMP（christie-atkinsonmunch-peterson）实验是GBS 鉴定的重要实验之一［2］。CAMP 因子与金黄色葡萄球菌产生协同溶血作用而出现β-溶血增强的现象称为CAMP 试验阳性［3］。国内外未见CAMP 实验阴性的人源性侵袭性感染GBS 的报道。本实验室筛查出1 株CAMP 实验阴性的人源性侵袭性感染GBS，拟通过普通培养法、细胞培养技术、流式细胞技术，比较分析CAMP 实验阴性株与阳性株在生长、黏附、抗吞噬、吞噬细胞内存活能力等特征的差异，并通过下一代测序技术分析实验菌株15 个与侵袭/毒力相关基因的差异，以期了解CAMP 因子人源性侵袭性感染过程中的可能作用，为进一步研究其功能和作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌株/细胞株

金黄色葡萄球菌ATCC25923、407 株GBS、Hep-2 人喉癌上皮细胞和RAW264.7 小鼠巨噬细胞均由南方医科大学珠江医院检验医学部保存。人新鲜全血为南方医科大学珠江医院临床废弃标本。

1.1.2 仪器与试剂

CD45 Per-CP-Cy5.5 抗体购于美国BD 公司，CFDA SE 细胞增殖与示踪检测试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司，细胞培养基购于美国Gibco 公司，平板及肉汤培养基购于广州市迪景微生物科技有限公司。Vitek2 微生物自动化分析仪购自法国Biomeriex 公司，流式细胞仪BD FACS Calibur Flow Cytometer 购自美国BD 公司，倒置显微镜TS100 购自日本Nikon 公司，倒置荧光显微镜AXIO Vert.A1 购自德国Zeiss 公司，CO2培养箱（细胞培养）HERA cell 150i 购自美国Thermo 公司，CO2培养箱（细菌培养）SHELZB2306-2S 购自美国HELLAB 公司。

1.2 方法

1.2.1 CAMP 试验

将本实验室冻存的407 株GBS 菌株分别接种于血琼脂平板上，35℃、5%CO2培养箱培养18～24 h。按CAMP试验操作规程［4］筛选CAMP阴性菌株。

1.2.2 不同环境生长曲线测定

取筛选出的CAMP 阴性株为实验菌株，另以1∶4 的取样配比选同期分离自血液的GBS 为对照实验菌株。取0.5 MCF 实验菌株和对照菌株等量分别接种于营养肉汤中，于pH 7.0 且温度分别为4℃、25℃、35℃培养，在培养4、5、6、7、8、9、10 h 时各自取100 μL 菌液测定细菌浓度，绘制不同温度下各菌株的生长曲线。同样的方法，使5 株菌在pH 4.0、pH 6.0、pH 7.0 但温度同为35℃的条件下培养，间隔一定时间取100 μL 菌液测定细菌浓度，绘制不同pH 下各菌株的生长曲线。

1.2.3 Hep-2 细胞黏附试验

将0.5 MCF 菌液稀释20 倍后，加入Hep-2 细胞浓度为3.0×105/孔的培养板中（底部放置多聚赖氨酸爬片）置于35℃、5%CO2培养箱孵育2 h；弃上清，洗涤3 次，取出细胞爬片，革兰氏染色，晾干后封片；用正置激光共聚焦显微镜对爬片进行镜检及计数，重复3 次，计算黏附率。

1.2.4 RAW264.7 小鼠巨噬细胞吞噬试验

将0.5 MCF 菌液稀释20 倍后，加入RAW264.7细胞浓度为2.9×105/孔的培养板中（底部放置多聚赖氨酸爬片）置于35℃、5% CO2培养箱孵育16 h；弃上清，洗涤3 次，取出细胞爬片，行革兰氏染色，晾干后封片；用正置激光共聚焦显微镜对爬片进行镜检及计数分析，重复3 次，计算吞噬率。

1.2.5 RAW264.7 小鼠巨噬细胞内存活试验

将0.5 MCF 菌液稀释20 倍后，加入RAW264.7细胞浓度为2.9×105/孔的培养板中，置于35℃、5%CO2培养箱孵育24 h；取出细胞板，弃上清，洗涤3次；裂解细胞，将裂解后的细胞溶液梯度稀释，涂布MH（mueller-hinton）平板进行菌落计数，重复3次，计算吞噬细胞内存活率。

1.2.6 人全血白细胞吞噬率试验

依据羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯（carboxyfluorescein diacetate，succinimidyl ester，CFDA SE）细胞增殖与示踪检测试剂盒说明书标记菌悬液，调浊度至0.5 MCF，取200 μL 菌液与等量新鲜全血充分混匀后置于35℃、5% CO2培养箱孵育2 h。取100 μL 菌血混合物与10 μLCD45 Per-CPCy5.5 抗体混合，避光标记15 min，随后加入450 μL 溶血素，立即上机，以侧向散射光SS 和CD45作图，检测有核细胞对不同菌株的吞噬率，重复3次，计算吞噬率。

1.2.7 人全血吞噬细胞内存活率试验

10 μL 0.5 MCF 菌液与190 μL 新鲜全血充分混匀后置于35℃、5%CO2培养箱孵育2 h，加入青霉素80 万单位继续孵育，20 h 后取出菌血混合物50 μL，充分混匀后将菌血混合物裂解、梯度稀释后涂布MH 平板，35℃、5%CO2培养箱培养24 h 后进行菌落计数。重复3 次，计算吞噬细胞内存活率。

1.2.8 基因组序列测定

菌株送广州华银医学检验中心进行序列测定和分析。

1.3 统计学方法

运用SPSS 20.0 软件进行统计分析。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较方差齐时采用LSD 检验，方差不齐时采用Dunnett's T3 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CAMP 实验

407 株GBS 仅1 株CAMP 实验阴性，该菌株分离自1 名2月龄男婴血液标本。选取这一株为实验菌株，另选4 株同期分离自血液的GBS 为对照实验菌株，菌株信息见表1。

表1 5 株GBS 信息Table 1 The information of five isolates of GBS

2.2 生长曲线测定

5 株GBS 在4℃或pH＜4.0 环 境 中 均 不 生长。在pH 7.0 且温度分别为25℃和35℃培养环境中，温度为35℃且pH 分别为pH 6.0、pH 7.0 培养环境中，CAMP 阴性和阳性菌株生长曲线见图1。

图1 GBS 生长曲线Figure 1 GBS growth curve

2.3 Hep-2 细胞黏附试验

共聚焦显微镜观察显示Hep-2 细胞周围存在GBS（图2）。5 株菌的黏附率分别为11.6%±1.1%、4.3%±0.5%、9.8%±0.7%、7.9%±0.2%、17.0%±0.6%，CAMP 实验阴性菌对Hep-2 细胞的黏附能力最强，差异有统计学意义（P<0.001）。

2.4 RAW264.7 小鼠巨噬细胞吞噬试验

图2 GBS 黏附Hep-2 细胞 （革兰氏染色，×100）Figure 2 Adhesion to Hep-2 cell of GBS（Gram，×100）

图3 GBS 被RAW264.7 细胞吞噬（革兰氏染色，×100）Figure 3 Phagocytosis to GBS of RAW264.7 cell（Gram，×100）

共聚焦显微镜观察显示RAW264.7 细胞内存在GBS（图3），表明GBS 可被RAW264.7 细胞吞噬。5株菌的吞噬率分别为3.5%±0.2%、3.1%±0.6%、3.7%±0.8%、3.5%±0.2%、13.4%±1.1%，RAW264.7 细胞对CAMP 实验阴性株的吞噬率高于CAMP 实验阳性株，差异具有统计学意义（P<0.001）。

2.5 RAW264.7 小鼠巨噬细胞内活性试验

5 株菌在小鼠巨噬细胞内24 h 存活率分别为10.9%±0.1%、16.1%±0.2%、13.6%±0.7%、15.7%±0.2%、10.9%±1.1%。CAMP 实验阴性株与阳性株菌株1 之间差异无统计学意义（P=0.92），但其小鼠巨噬细胞内24 h 存活率低于其它3 株CAMP 实验阳性株，差异有统计学意义（P＜0.001）。

2.6 人全血白细胞吞噬率试验

流式细胞仪计数人全血中性粒细胞对5 株菌的吞噬率分别为10.7%±0.4%、14.1%±0.2%、21.1%±0.7%、9.5%±0.3%、26.2%±0.5%，结果显示CAMP 实验阴性菌最容易被中性粒细胞吞噬，差异有统计学意义（P＜0.001）。流式细胞分析结果还显示：单核细胞对5 株菌的吞噬率分别为60.1%±0.6%、61.3%±0.2%、52.3%±1.4%、64.7%±1.9%、86.5%±0.2%。CAMP 实验阴性菌也最容易被单核细胞吞噬，差异有统计学意义（P＜0.001）。图4所示为CAMP 实验阴性株和阳性株菌株1 的流式细胞仪检测结果。

2.7 人全血白细胞内存活率试验

5 株菌在人全血白细胞内24h 存活率分别为38.1%±3.3% 、34.4%±4.8% 、41.9%±11.0% 、42.8%±0.3%、19.6%±0.8%，将4 株阳性菌与阴性菌分别进行两两比较，P值分别为P=0.002、P=0.008、P=0.001、P＜0.001，CAMP 实验阴性菌在白细胞内存活率最低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

2.8 基因组序列测定

5 株菌进行了基因组重测序，并比较了5 株GBS 的fbsA、fbsB、scpB、lmb、bca、hylB、cfb、cyl、gbcA、neuA、neuB、neuC、neuD、rib、sip基因序列，发现CAMP 实验阴性菌株缺失cfb基因。其他毒力基因在5 株菌中均有检出。

图4 人全血白细胞吞噬GBS 的流式细胞仪检测结果Figure 4 Flow cytometry results of human whole blood leukocytes phagocytizing GBS

3 讨论

GBS 通常正常定植于人体胃肠道及阴道，是一种条件致病菌。成年人感染类型主要包括肺炎、败血症、尿路感染、皮肤软组织感染等。GBS可通过孕产妇产道上行感染引发早产、流产、胎膜早破，也可通过母婴的垂直传播，引发新生儿败血症和脑膜炎［5］，是一种围产期重点监测的病原菌。已有研究表明，GBS 致病主要涉及各种黏附因子（如纤维蛋白原结合蛋白、层黏蛋白结合蛋白、丝氨酸重复蛋白、免疫原性细菌黏附蛋白、αC 蛋白等）以及各种毒力因子（如CAMP 因子、细胞溶血素、荚膜多糖等）［6］。其中CAMP 因子是一个促溶血因子，能与金黄色葡萄球菌分泌的β 溶血毒素（神经磷脂酶C）共同作用，引发绵羊红细胞溶血程度增加［7］，在血平板上形成伞状的透明溶血区域。由于CAMP 因子对GBS 有很高的特异性，因此广泛的被临床实验室用作鉴定GBS 的重要试验［8］，其编码基因cfb常作为临床GBS 检测的分子靶标［9］。

虽然有研究表明CAMP 因子在机体系统感染过程中能削弱宿主的免疫功能［10］，是一种重要的致病因子，也在活体动物试验中发现纯化的CAMP 因子可导致兔子及小鼠死亡［3，11-12］，但Mary等［13］通过对cfb基因进行等位基因替换后的体外及体内试验研究认为CAMP 因子在GBS 的毒力系统中不是必须的。因此，有关CAMP 因子在侵袭性感染过程中的作用和作用机制还存在争议。

牛源、鱼源性GBS 分离株中有少量CAMP 阴性菌株的报道，但人源性CAMP 阴性GBS 仅见个案报道［14-15］。刘家玲等［15］的初步研究显示CAMP阴性菌株的基因组中含有cfb基因，推测是由于cfb基因突变导致的CAMP 阴性，或是由于调控元件CovR/S 的突变导致的CAMP 阴性。CovR/S 是GBS中重要的毒力因子相关基因的调控元件，可调控CAMP 因子编码基因cfb及细胞溶血素的编码基因cylE等。在CovR/S 突变的GBS 菌株中可看到GBS的β-溶血素增加及对各种上皮细胞的黏附增加，但CAMP 因子的活性下降的现象［16］。这与本实验中观察到的CAMP 阴性菌株对Hep-2 细胞的黏附能力最强现象相一致。由于CAMP 阴性GBS 的生物学意义未被充分认识，因此相关研究未见报道。

除了cfb基因，目前还有一些其他已知的毒力基因［12，17-18］：fbsA（编码纤维蛋白原结合蛋白A）、fbsB（编码纤维蛋白原结合蛋白B）、lmb（编码层黏蛋白结合蛋白）、bca（编码αC 蛋白）、scpB（与C5a肽酶有关）、neuA-D（编码荚膜多糖）、cyl（溶血素的分子基础）、hylB（编码透明质酸裂解酶）及gbcA、rib、sip（编码表面蛋白）等与GBS 对宿主细胞的黏附、侵袭或免疫逃避有关。为分析上述毒力基因在5 株GBS 中的分布差异，本研究应用下一代测序技术对5 株菌进行基因组重测序，测序结果表明，CAMP 阴性株cfb基因完全缺失，但其他已知毒力相关基因（fbsA、fbsB、scpB、lmb、bca、hylB、cyl、gbcA、neuA、neuB、neuC、neuD、rib、sip）在CAMP 阴性菌和4 株CAMP 阳性菌中均有检出。

不同于其他研究者使用基因工程质粒研究CAMP 因子生物学功能，本研究基于人源性侵袭性CAMP 因子天然缺失株，避免了引入外源性质粒本身对实验菌生物学表征的影响。初步研究结果显示CAMP 实验阴性株在黏附、抗吞噬以及吞噬细胞内存活能力等方面与阳性株之间存在显著差异，表明CAMP 因子确实是一种重要致病因子。但该株菌仍能引发严重侵袭性感染，又提示在CAMP 实验阴性GBS 侵袭性感染过程中可能存在代偿机制或途径。本研究为深入探讨CAMP 因子的生物学功能及作用机制奠定了基础。