中国南方客家人群乙醛脱氢酶2基因多态性与急性心肌梗死的相关性研究

侯经远 谢运泉 赵平森 钟志雄

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是心血管疾病中的严重类型，具有高致病、高致死致残等特点，已成为威胁全世界公共健康的重要问题［1］。在我国，AMI 患病率及死亡率仍处于上升阶段并且呈年轻化的趋势，严重危害人民健康［2］。AMI 发病机理非常复杂，主要由遗传、环境等因素共同导致［3］。在传统危险因素基础上增加基因多态性等遗传易患因素预测AMI 发病率的研究成为近几年热点。乙醛脱氢酶2（aldehyde dehydrogenase-2，ALDH2）基因位于人类染色体12q24.2，其在第12 个外显子上发生点突变，即鸟嘌呤（G）被腺嘌呤（A）替换，使编码第504 位氨基酸的密码子改变，从而谷氨酸被赖氨酸替换（Glu504Lys），导致ALDH2 酶活性的显著下降［4］。人群中ALDH2基因可根据其突变情况分为GG、GA 和AA 3 种不同的基因型。目前ALDH2在体内的作用机制尚未完全阐明，近年来研究发现ALDH2基因多态性与冠心病发病相关，但研究结论尚不一致，且ALDH2基因多态性在不同地区、民族间差别较大［5-6］。本研究旨在探讨在中国南方客家人群中，ALDH2基因Glu504Lys 位点的多态性与AMI 的关系，以期从基因角度探寻AMI 相关遗传易患因素，为AMI 的防治提供新的思路。

1 对象与方法

1.1 研究对象

本研究选取2016年5月至2018年5月就诊于梅州市人民医院心血管内科住院且首次患AMI 者共252 例作为病例组，其中男187 例、女65 例，平均年龄（69.6±11.1）岁，年龄范围38～95 岁。所有AMI 患者诊断根据临床表现、心电图及冠状动脉造影证实，且必须至少符合下列3 条标准中的2条：①缺血性胸痛的临床病史；②心电图的特征性动态变化；③心肌损伤坏死的血清标志物浓度的动态改变。另选取同期来我院门诊进行体检的健康者264 例作为对照组，其中男165 例、女99 例，平均年龄（62.8±11.9）岁，年龄范围40～94 岁。排除标准：先天性心脏病、近期均无严重创伤或感染性疾病、严重肝肾功能不全、血液性疾病，恶性肿瘤或自身免疫性疾病。纳入的所有研究对象均为三代以内居住在广东省梅州境内的客家人且所有研究个体之间无血缘关系。本研究经患者及家属知情同意并签署知情同意书，研究方案获本院伦理委员会审批同意。

1.2 研究方法

1.2.1 主要试剂和仪器

主要试剂为天根生化科技（北京）有限公司血液基因组DNA 提取试剂盒DP318，上海百傲科技股份有限公司ALDH2（Glu504Lys）基因检测试剂盒（DNA 微阵列芯片法），北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司ALDH2基因检测试剂盒（荧光PCR-毛细管电泳测序法）。主要仪器为赛默飞世尔科技（中国）有限公司NanoDrop 2000 紫外-可见分光光度计，美国伯乐S1000 PCR 仪，上海百傲科技股份有限公司BR-526-24 全自动杂交仪，上海百傲科技股份有限公司BaiO®BE-2.0 生物芯片识读仪。美国贝克曼库尔特有限公司AU5400 型全自动生化分析仪。

1.2.2 血液采集和DNA 提取

患者入院即抽取肘静脉血2～3 mL，置于EDTA抗凝管中，采用人血液基因组DNA 提取试剂盒（离心柱型DP318，天根生化科技（北京）有限公司）抽提全血基因组DNA。用NanoDrop 2000 紫外-可见分光光度计测定提取DNA 浓度和A260/A280比值，DNA 模 板 要 求 比 值 在1.7～2.0 之 间。DNA 的 浓度和纯度均符合PCR 扩增要求。提取的标本储存于-80℃冰箱备用，避免反复冻融。

1.2.3ALDH2基因多态性检测

采用DNA 微阵列芯片法检测ALDH2基因多态性，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书［上海百傲科技股份有限公司ALDH2（Glu504Lys）基因检测试剂盒］进行。将提取和纯化好的DNA 加入至聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）体系中，用ALDH2基因特异性引物PCR 扩增。反应体系为25 μL，其中ALDH2 扩增液22 μL、反应液A 1 μL 和基因组DNA 2 μL。PCR 扩增条件如下：50℃5 min；94℃预变性5 min；94℃变性25 s，60℃退火25 s，72℃延伸30 s，35 个循环；72℃延伸5 min。扩增结束后，吸取190 μL 杂交缓冲液，加入10 μL PCR 扩增产物，在全自动杂交仪上将带有生物素标记的扩增产物特异性地与固定于玻片载体上的ALDH2基因检测探针进行杂交反应，然后酶促显色（上海百傲科技股份有限公司BR-526-24）。反应结束后，取出生物芯片并放入芯片识读仪（上海百傲科技股份有限公司BaiO®BE-2.0），用芯片图像分析软件进行扫描和分析，判断样品的ALDH2基因型。为保证ALDH2基因分型的准确性，随机抽取10%的DNA 样本采用荧光PCR-毛细管电泳测序法重新进行DNA 测序验证（北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司ALDH2基因检测试剂盒）。

1.3 统计学处理

所有数据采用SPSS 19.0 软件进行统计学分析。计量资料以均数± 标准差（x±s），计数资料以频数和百分比表示。两样本均数比较采用独立样本t检验或Mann-whitney 非参数检验，计数资料比较采用χ2检验。以Hardy-Weinberg（HWE）平衡检验样本是否具有群体代表性。ALDH2基因型和等位基因频率分布采用χ2检验比较。采用二元Logistic 回归分析危险因素，计算比值比（odds ratio，OR）及其95%可信区间。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般临床资料比较

两组一般临床资料比较结果如表1所示。AMI 组的男性占比例、年龄、收缩压、饮酒史、高血压、糖尿病、高脂血症患病率及血清总胆固醇、低密度胆固醇脂的血清学水平与对照组比较差异具有统计学意义（P＜0.05），其中AMI 组高密度胆固醇酯水平的血清学水明显低于健康对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。此外，舒张压、吸烟史和甘油三酯的血清学水平比较两组间差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 两组一般临床资料比较Table 1 Comparision of basic characteristics of the two group

2.2 ALDH2 基因型和等位基因频率分布比较

ALDH2基因Glu504Lys 位点DNA 微阵列芯片法基因分型结果如图1所示。经DNA 微阵列芯片法基因分型检测，ALDH2基因型和等位基因频率在AMI 组及对照组中的分布情况结果如表2所示。ALDH2基因型分布经遗传平衡χ2检验，结果显示：AMI 组（χ2=0.011，P=0.918）；对照组（χ2=0.540，P=0.463）。两组ALDH2基因型和等位基因频率分布均符合HWE 遗传平衡，表明所有入选的研究对象均具有人群代表性（P>0.05）。ALDH2基因型和等位基因频率的分布在两组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。其中，AMI 组ALDH2GG、GA 和AA 基因型所占比例分别为45.63%、44.05%和10.32%，G 和A 等位基因频率分别为67.66%和32.34%。对照组ALDH2GG、GA 和AA基因型所占比例分别为56.82%、35.98%和7.20%，G 和A 等位基因频率分别为74.81%和25.19%。

图1 ALDH2 基因Glu504Lys 位点基因芯片分型图Figure 1 Microarray genotyping ofALDH2 gene Glu504Lys

表2 ALDH2 基因型和等位基因频率分布Table 2 The genotype and allele frequencies of ALDH2 Glu504Lys in AMI patients and controls

2.3 AMI 相关危险因素的Logistic 回归分析

将所有候选变量引入多因素Logistic 回归模型，采用逐步回归方法筛选独立危险因素，以年龄、性别、吸烟、饮酒、高血压病、糖尿病、高脂血症及ALDH2基因型为自变量，以是否患有AMI 为因变量。Logistic 回归分析结果显示，年龄、性别、饮酒、高血压病、糖尿病、高脂血症是AMI 发生的危险因素。其中，与GG 基因型相比，ALDH2GA/AA 基因突变型携带者患AMI 的风险增高，提示GA/AA 基因型是AMI 发生的独立危险因素（OR=1.906，95%可信区间：1.278～2.844，P=0.002），见表3。

表3 AMI 发生相关危险因素的Logistic 回归分析Table 3 Logistic regression analysis of the potential risk predictors of AMI

3 讨论

AMI 是世界范围内致病率和致死率居前的危重疾病，严重威胁人类健康，如何有效地实现AMI的早期预防和早期诊断成为心血管疾病研究领域的重要课题［1］。现有证据表明，AMI 是由遗传因素与各种环境因素共同作用导致的复杂性疾病，研究报道已发现多种与AMI 发生相关的基因［3］。人ALDH2基因定位于染色体12q24.2 上，长44 kb，由13 个外显子组成［3］。ALDH2基因的遗传多态性存在两种表型，具有催化活性的G 等位基因和丧失活性的A 等位基因。早期研究显示，不同地域、民族之间ALDH2基因多态性之间存在差异［5］。ALDH2基因Glu504Lys 位点在亚洲人群中的突变率显著高于高加索人、欧洲人和美国黑人（东亚人群中ALDH2的突变比例达30%～50%），占世界人口的8%，并且在中国、韩国和日本等东亚不同国家人群中也存在一定地区差异［5-6］。因此，研究亚洲人群ALDH2基因与疾病的关系已经成为近年来的关注热点［7］。

目前，国内外研究表明ALDH2基因在冠心病的发生发展中起重要作用［8-9］。一项基因组关联分析研究报道ALDH2基因多态性与冠心病遗传易感性相关［10］。杨美艳等［11］在高龄老年人中发现ALDH2基因突变型是动脉粥样硬化发生的危险因素。有研究则在研究大鼠心肌缺血/再灌注损伤模型中证实ALDH2高活性能够显著降低心肌梗死面积，而抑制ALDH2活性则使心肌细胞凋亡显著增加［12］。日本和韩国学者研究先后报道ALDH2基因突变型是心肌梗死（myocardial infarction，MI）发生的独立危险因素［13-14］。中国学者Pan 等［15］报道ALDH2基因多态性与急性冠脉综合征不良预后相关。近年来，多项荟萃分析也表明ALDH2基因Glu504Lys 单核苷酸多态可能增加冠心病和心肌梗死易感性，但结论存在争议［16-17］。

氧化应激是缺血再灌注损伤最主要的机制，体内外的各种研究证据表明ALDH2在减轻心肌细胞氧化损伤、抑制细胞凋亡等重要心脏保护性作用［18］。有研究在诱导干细胞来源的心肌细胞模型中发现，ALDH2基因的突变导致活性氧和毒性醛的水平上升，并且诱导细胞周期停滞、凋亡信号通路激活［19］。另外一项研究则发现转染缺失型ALDH2cDNA 后PC12 细胞对醛类物质4-羟壬烯（4-HNE）敏感性增加［20］。此前有报道ALDH2参与缺血前适应相关信号转导通路，其活性与心肌梗死面积呈显著负相关［12］。也有多项研究表明ALDH2酶失活或活性下降后，可致使体内拮抗氧化应激及炎症反应的能力减弱，进而导致动脉粥样硬化的进展和AMI的发生，但相关病理机制有待进一步阐明［21-22］。

本研究纳入梅州地区客家人群共252 例AMI患者和264 例健康对照者，按ALDH2基因型分为GG 型、GA 型和AA 型3 个型别，分析ALDH2不同基因型及等位基因频率的分布。结果显示，AMI 组ALDH2GA（44.05%）和AA（10.32%）基因型比例和A 等位基因（32.34%）的突变频率远高于对照组（35.98%、7.20%和25.19%），差异具有显著性（P＜0.05），提示A 等位基因可能与AMI 易感性有一定相关性，与目前部分研究报道相一致［13，23］。然而值得注意的是不同种族和人群ALDH2 基因多态性存在差异从而导致研究结论尚不一致［16］，前期研究发现广东梅州地区客人人群ALDH2基因多态性频率与其它地区有所不同［5］。因此，上述结论尚需扩大样本量以及在不同地域人群中进一步验证。环境和遗传易感因素在AMI 的发生发展中起互相促进互相影响，是影响早期冠状动脉粥样硬化轻重程度的重要环节［3，24］。客家人是居住在岭南地区有上千年历史、具有独特遗传背景的汉族民系分支，有着相对特殊的生活方式、饮食习惯、文化民俗等方面具有鲜明的不同于其他民族的特征［25］。本研究中，Logistic 回归分析显示，年龄、性别、饮酒、高血压病、糖尿病、高脂血症史是中国南方客家人群AMI 发病的危险因素。此外，本研究发现在校正上述传统危险因素后，ALDH2GA/AA 基因型携带者发生AMI 风险仍然明显高于GG 基因型携带者（OR=1.906，95%可信区间：1.278～2.844，P=0.002）。因此，推测GG 基因型可能通过影响ALDH2酶活性从而在减轻心肌缺血及抗氧化应激等方面发挥着重要心肌保护作用［18，21］，但其确切机制还有待进一步深入研究。

综上所述，本研究发现ALDH2基因Glu504Lys位点多态性与AMI 相关，ALDH2GA/AA 基因型可能是AMI 的独立危险因素。本研究结果表明ALDH2基因在中国南方客家人群AMI 的发病中可能起到重要作用，为AMI 的早期预警提供依据，具有一定的临床意义。然而，上述研究结果与部分既往研究的不同可能与病例选择、样本量大小、地理环境、种族以及饮食习惯等诸多因素有关，尚需在不同种族和地区人群中进行大样本的临床研究。随着人们对ALDH2基因在AMI 发生发展过程中确切机制研究的不断深入，必将为AMI 风险预测和个体化治疗提供新的思路和治疗靶点。