结肠癌患者组织中AKT2、Annexin A1表达水平及其临床意义

孙清森 孙连生 徐建利 谷斌 李超

结肠癌为全球最常见恶性肿瘤之一，受人口老龄化、环境污染等因素影响，结肠癌发病率也呈逐年升高趋势［1］。结肠癌的发生可涉及多基因、多步骤，包括癌基因的活化及抑癌基因的失活，寻找结肠癌发生过程中分子遗传学改变，以建立简便可行的评估指标，成为近年学术界研究的热点［2］。丝/苏氨酸蛋白激酶2（serine/threonine kinase protein 2，AKT2）与蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）、蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）具有高度同源性，亦称为蛋白激酶B（protein kinase B，PKB），是病毒癌基因的表达产物在细胞内的同源类似物，能促进蛋白质合成和促进糖原转运，在结肠癌、胃癌等癌组织中均能过度表达或激活［3］。膜联蛋白A1（annexin A1）是一类钙依赖的磷脂结合蛋白，可参与细胞多种重要生理功能过程，包括细胞信号传导、炎症反应、脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）修复及细胞凋亡等过程，在肝癌、结肠癌等癌组织中呈高表达［4］。基于此，本研究选取64例行择期根治术治疗的结肠癌患者为研究对象，以分析结肠癌患者癌组织AKT2、Annexin A1 表达情况与临床病理特征的关系，评估AKT2、Annexin A1 的临床意义，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年3月 至2018年5月本 院64 例 行择期根治术治疗的结肠癌患者为研究对象。纳入标准：①经病理学检查确诊为结肠癌者；②年龄为40～75 岁者；③沟通能力良好者；④签署知情同意书者；⑤经本院医学伦理委员会审批者。排除标准：①术前行放化疗者；②结肠手术史者；③围术期死亡者。64 例结肠癌患者中男性42 例，女性22例；年龄43～71 岁，平均（58.87±10.22）岁。

1.2 方法

使用免疫组化法检测AKT2、Annexin A1 在癌组织及癌旁组织（距肿瘤边缘≥3 cm 且镜下无癌细胞）中的表达情况，具体步骤如下：将癌组织及癌旁组织石蜡标本4 μm 连续切片后脱蜡水化，浓度为3%的甲醛过氧化氢孵育后，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗，微波法抗原热修复后滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育；分别滴加一抗工作液4℃孵育过夜，复温后PBS 冲洗，滴加二抗工作液，37℃孵育30 min，PBS 冲洗后滴加适量底物显色液二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）；苏木素复染5 min，二甲苯透明，树脂封片，镜检。

1.3 试剂及仪器

AKT2 鼠抗人单克隆抗体购自美国SANTA CRUZ 公司，Annexin A1 鼠抗人单克隆抗体购自美国Abcam 公司，鼠抗人即用型免疫组化试剂盒购自福建迈新生物公司，PBS、DAB 等试剂均购自福州迈新生物技术开发有限公司；切片机、石蜡包埋机购自德国Leica 公司，微波炉购自广东格兰仕集团有限公司，显微镜购自日本Olympus 公司。

1.4 染色结果判定方法［5］

由2 名高年资病理医师独立评分；先根据细胞染色强度评分，细胞无变色计0 分，浅黄色计1 分，棕黄色计2 分，黄褐色计3 分；再随机选取10 个视野，观察阳性细胞百分比，计算10 个视野阳性细胞平均百分比，将阳性细胞百分比＜10%计0 分，10%～20%计1 分，21%～50%计2 分，＞50%计3 分；上述2 项评分的乘积为每例标本的染色积分，积分＜3分为阴性，≥3 分为阳性。

1.5 统计学方法

应用SPSS 21.0 软件进行统计学分析，计数资料以例或百分比n（%）表示，采用χ2检验，以P<0.05 为有统计学意义。

2 结果

2.1 结肠癌患者癌组织及癌旁组织AKT2、Annexin A1 表达情况

结肠癌患者癌组织AKT2、Annexin A1 阳性率均高于癌旁组织（χ2=42.792、24.500，P<0.05）。见表1。

2.2 癌组织AKT2 蛋白表达与结肠癌临床病理特征的关系

AKT2 在不同性别、年龄、肿瘤直径、肿瘤部位、分化程度、病理类型的结肠癌患者癌组织中表达情况比较，差异无统计学意义（P>0.05）；但AKT2 在伴淋巴结转移、浸润深度高、Dukes 分期高的结肠癌患者癌组织中表达阳性率高（P<0.05）。见表2。

2.3 癌组织Annexin A1 蛋白表达与结肠癌临床病理特征的关系

Annexin A1 在不同性别、年龄、肿瘤直径、肿瘤部位、分化程度、病理类型的结肠癌患者癌组织中表达情况比较，差异无统计学意义（P>0.05）；但Annexin A1 在伴淋巴结转移、浸润深度高、Dukes分期高的结肠癌患者癌组织中表达阳性率高（P<0.05）；见表3。

表1 结肠癌患者癌组织及癌旁组织AKT2、Annexin A1 表达情况［n（%）］Table 1 Expression levels of AKT2 and Annexin A1 in cancer tissues and adjacent tissues of patients with colon cancer［n（%）］

表2 癌组织AKT2 蛋白表达与结肠癌临床病理特征的关系Table 2 Relationship between AKT2 protein expression in cancer tissues and clinicopathological features of colon cancer

3 讨论

近年来，分子生物学发展迅速，基因靶向治疗成为肿瘤治疗的新方向，抗血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等靶向药物随之出现，为改善恶性肿瘤患者生存质量创造条件［6］。AKT2 是丝/苏氨酸蛋白激酶（serine/threonine kinase，AKT）的一个亚型，可介导细胞生存通路磷酯酰肌醇3 激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/AKT，而促进细胞生长、增殖、运动、侵袭，抑制细胞凋亡，在血管新生中也具有积极调节作用［7］。Annexin A1 在不同恶性肿瘤组织中表达水平不同，在乳腺癌、结肠癌组织呈高表达，而在食管鳞癌、前列腺癌中表达下降，但Annexin A1不同表达水平可通过修饰后蛋白的磷酸化及去磷酸化2 种形式，均引起细胞过度增生，使其具有促肿瘤形成作用［8］。对此，本研究也就AKT2 及Annexin A1 在结肠癌组织中的表达情况展开分析，以评估2 者与结肠癌临床病理特征的关系，为临床基因靶向治疗提供新思路。

表3 癌组织Annexin A1 蛋白表达与结肠癌临床病理特征的关系Table 3 Relationship between Annexin A1 protein expression in cancer tissues and clinicopathological features of colon cancer

AKT2、Annexin A1 在结肠癌癌组织中高表达，对结肠癌的发生发展中具有重要作用。另外，外国学者研究发现，AKT2 可通过多种途径促进肿瘤细胞增殖，其在肿瘤组织中的表达水平与其分化程度、肿瘤大小密切相关［9］。而本研究中，AKT2在不同肿瘤直径、肿瘤部位、分化程度、病理类型的结肠癌患者癌组织中表达情况比较，差异均无统计学意义，与上述学者研究结果不同。推测该结果由以下2 个方面因素引起：①结肠癌肿瘤的生长与多种信号通路相关，仅观察AKT2 一项内容未必能准确评估其分化程度及肿瘤体积［10］；②本研究纳入样本量较小，造成检验效能较低，需要扩大样本量，以验证该结果的准确性［11］。且AKT2 在不同性别、年龄结肠癌患者肿瘤组织中表达易无明显差异，与Popp 等学者［12］研究结果一致。说明结肠癌患者肿瘤组织中AKT2 表达水平不受性别、年龄的影响。故AKT2 表达水平在评估不同性别、年龄的结肠癌患者肿瘤进展中也有重要作用。此外，Annexin A1 在不同性别、年龄、肿瘤直径、肿瘤部位、分化程度、病理类型的结肠癌患者癌组织中表达情况比较，差异无统计学意义。这也提示，Annexin A1 单项指标难以评估结肠癌肿瘤直径、肿瘤部位、分化程度、病理类型，仍需探索其他肿瘤标志性蛋白，以完善对直径、分化程度等肿瘤进展情况的评估。

除上述结论外，本研究还发现，AKT2 在伴淋巴结转移、浸润深度高、Dukes 分期高的结肠癌患者癌组织中表达阳性率高。提示AKT2 能通过介导PI3K/AKT 通路，促进结肠癌肿瘤细胞增殖，刺激其转移潜能，使其侵袭能力升高［13］。此外，AKT2 也能通过调节PI3K/AKT 通路促进血管新生，并刺激淋巴管增生扩张，促进肿瘤细胞进入淋巴管，引起淋巴结转移［14］。Song 等学者［15］也提出，PI3K/AKT 通路在结肠癌进展、浸润、转移及预后中具有重要作用。因此，AKT2 能利用PI3K/AKT 通路，与结肠癌恶性程度、淋巴结转移密切相关。不仅如此，Annexin A1 也在伴淋巴结转移、浸润深度高、Dukes 分期高的结肠癌患者癌组织中表达阳性率高，与魏礼清等学者［16］研究结果一致。说明Annexin A1 也与结肠癌侵袭能力及淋巴结转移情况密切相关。分析其原因可能与Annexin A1 能介导肿瘤细胞内信号传导，而促进其侵袭能力增加［17］；且参与机体炎症反应过程，刺激淋巴管扩张，使结肠癌肿瘤细胞淋巴结转移风险升高有关［18］。近年，Biaoxue 等学者［19］也发现，Annexin A1 能通过参与酪氨酸激酶磷酸化过程，并抑制磷脂酶A2 活性，促进肿瘤增殖。提示能通过多种路径参与肿瘤细胞增殖、侵袭、转移等过程。但Annexin A1 作为一种新型肿瘤标志蛋白，作用途径仍在探索中，其对肿瘤细胞的调控路径仍需进一步探讨。

综上所述，AKT2 及Annexin A1 与结肠癌淋巴结转移、浸润深度高、Dukes 分期均密切相关，在反映结肠癌发生、发展及生物学行为方面具有重要作用，检测AKT2、Annexin A1 组织表达水平对评估结肠癌患者预后有积极意义。