毛囊角化病一家系ATP2A2基因突变的检测

喻 标，杨庆华，任建文，陈少秀，景海霞，段德鉴

毛囊角化病又称Darier病（Darier"s disease，DD），是一种少见的以表皮细胞角化不良为基本组织病理变化的慢性角化性皮肤病，呈常染色体显性遗传。临床表现为皮脂溢出部位多发的、小的红褐色丘疹，伴有瘙痒和疼痛，其他的皮肤表现还有掌跖角化性凹点以及甲萎缩[1]。其分子基础已被证实为编码肌浆网/内质网钙泵ATP酶2的基因ATP2A2发生突变[2]。本研究收集了一个DD家系，应用直接测序的方法对其ATP2A2基因突变进行检测。

1 材料与方法

1.1 临床资料

该家系共4代18人，6人患病（图1）。先证者男，12岁，6年前颈部出现淡褐色丘疹，自觉瘙痒，皮损逐渐增多，累及面部、腋窝、腹部（图2a）。其母皮损泛发，面颈部、腹部、双侧腋窝、腹股沟以及手足背广泛受累，呈对称密集多发的褐色坚实丘疹，部分皮损融合成斑块，日晒或出汗加重，同时伴有指（趾）甲受累（图2b）。其舅临床表现与其母类似，皮损以面颈部及胸背部为甚。先证者、其母及其舅各系统检查均未见异常。组织病理检查示表皮角化过度，棘层肥厚，乳头瘤样增生，基底层上裂隙形成，可见棘层松解细胞，真皮慢性炎性细胞浸润（图3）。诊断：毛囊角化病。

图1 毛囊角化病患者家系图

1.2.1 外周血基因组DNA提取 征得患者同意后，采集所有患者及家系中正常人外周血各5.0 ml，同时采集100例无亲缘关系的正常个体外周血各5.0 ml，并提取基因组DNA作为对照，以排除基因多态性。血样均经2%EDTA抗凝，-80 ℃保存备用。采用DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）提取基因组DNA。

1.2.2ATP2A2基因全部外显子的PCR扩增 按照参考文献[3]设计特异性引物18对，扩增包括21个外显子及其与内含子交界区的序列。其中外显子18引物序列：上游5"-GGGTTGGAGCCTGGACTTG-3"，下游5"-TTTTGGGAAGGGAAGAACTGT-3"。扩增条件：18号外显子，95 ℃变性30 s，57 ℃复性30 s，72 ℃延伸 1 min，共35个循环，总反应体系50 µl。1.5% 琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物。

1.2.3 直接测序 PCR产物纯化送上海桑尼公司，经ABI377型DNA测序仪使用染料终止剂化学方法进行测序。测序结果采用Chromas软件（版本2.0）对基因序列进行对比分析，确定突变位点。

图2 毛囊角化病患者腹部（先证者）、双手(母亲)皮损

图3 毛囊角化病先证者颈部皮损组织病理（HE染色）

图4 先证者和正常对照者ATP2A2基因第18外显子PCR扩增部分序列图

2 结果

通过PCR产物直接测序，在患者ATP2A2基因第18外显子中发现一个错义突变，即在2728核苷酸处碱基A变成G（c.2728 A→G），导致先证者在910位（p.910 N→D）将天冬酰胺（AAC）替换为天冬氨酸（GAC）。先证者的母亲和舅舅均发现存在同样的突变，家系中其他未发病成员及正常对照100例经测序未发现有此突变（图4）。

3 讨论

DD是一种少见的常染色体显性遗传性皮肤病。典型的DD皮损为油腻性，棕褐色密集的毛囊小丘疹，表面覆盖痂皮，去除痂皮后丘疹顶端暴露漏斗状小凹，丘疹增大可趋向融合，形成不规则疣状斑块，伴有瘙痒和疼痛，其他皮肤表现有掌跖角化性凹点及甲病变。临床上应注意与融合性网状乳头瘤病、黑棘皮病、脂溢性角化、暂时性棘层松解性皮病及疣状角化不良瘤等鉴别；在组织病理上需与慢性家族性良性天疱疮鉴别[4]。

DD致病基因为ATP2A2，定位于12q23-q24.1，编码肌浆/内质网钙离子-ATP酶2（SERCA2）[5,6]。该基因长度约为76 kb，由21个外显子组成，经选择性剪切其产物形成3种亚型：SERCA2a、SERCA2b和SERCA2c，分别由997、1 042、999个氨基酸组成。3种SERCA2同工酶蛋白质序列前993个氨基酸相同，而羧基端存在差异，SERCA2b有一个延伸的羧基末端[6,7]。3种亚型的分布具有组织特异性，SERCA2a主要表达于心肌和慢速收缩骨骼肌；SERCA2b、SERCA2c则广泛存在[7]，其中，SERCA2b主要表达于平滑肌和非肌肉组织中，包括角质形成细胞[5,8]。人类表皮中发现的主要亚型即SERCA2b，该型在表皮生物学中起关键作用，其突变影响了蛋白的表达、降解和活性，进而影响了表皮间黏附分子的表达和角质形成细胞的正常角化，致使出现棘细胞间的松解，最终导致Darier病[9]。

自从1999年首次报告ATP2A2基因突变以来，在353个家系或散发的DD患者中，共发现了253种独特的突变，其中包括118个错义突变和22个无义突变、21个重复、9个插入、51个缺失、27个剪接位点和3个插入/缺失突变[10]。但是，ATP2A2基因没有所谓的突变热点，这些突变位点分散在整个ATP2A2基因中[10,11]。相对而言，在ATP2A2基因两个最大的外显子8和14中发现了更多的突变[10]。大多数突变是单个家族所特有的，没有证据表明基因型和表型之间的关系[11]。然而Sakuntabhai等[3]报道指出，严重的疾病表型主要见于错义突变或框内缺失突变的患者，而不是无义突变或移码突变。Akagi等[12]则认为糜烂性皮损可能受突变基因型影响，提示DD的突变基因型与临床表型之间可能存在一定的相关性。

本研究发现并证实了一个新的错义突变，即在患者ATP2A2基因第18外显子2728位碱基A为G取代（c.2728 A→G），进而导致氨基酸N910D改变。突变位置上，本研究突变c.2728 A→G位于SERCA2的跨膜区M8，该区域与另外3个跨膜结构域M4、M5、M6共同组成SERCA分子的两个Ca2+结合位点[13]。推测突变导致该单体的功能缺陷，进而相互影响，导致SERCA2b总体功能上的改变,使表皮内角质形成细胞的黏附和分化功能发生异常，最终促使该病发生。本研究扩大了DD患者ATP2A2基因突变数据库，有助于阐明ATP2A2突变在DD发病中的分子机制。