Foxp3+调节性T细胞在播散性毛孢子菌病小鼠模型的表达研究

敖俊红，祝 贺，廖 勇，杨冬倩，李海涛，杨蓉娅

阿萨希毛孢子菌（Trichosporon asahii, T. asahii）是毛孢子菌属中重要的临床致病菌，可导致深部感染和夏季超敏性肺炎，T. asahii是播散性毛孢子菌病的主要病原菌[1,2]。近年来，随着糖皮质激素和免疫抑制剂的应用，以及肿瘤、血液病、艾滋病的增多，该病发病率逐年上升[3-5]。T. asahii进入宿主体内后是否致病，由宿主的免疫防御状态和菌株致病力等因素决定。国际上报道由阿萨希毛孢子菌所致的播散性毛孢子菌病几乎均是在恶性肿瘤、白血病基础上继发感染所引起。由阿萨希毛孢子菌引起的播散性感染较难治愈，症状容易反复，预后较差[6]。因此，了解宿主感染阿萨希毛孢子菌过程中限制保护性免疫应答的因素可能为进一步研发有效的靶向治疗措施提供免疫学理论基础。CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞是一类可调节其他免疫细胞增殖、分化与功能，维持机体免疫稳态和免疫耐受的CD4+T淋巴细胞亚群，在自身免疫性疾病、肿瘤、器官移植及慢性感染等疾病中发挥重要作用。转录因子Foxp3（forkhead box p3）是调节性T细胞的特异性标志，对调节性T细胞发育、分化及功能维持起重要作用[7]。研究发现在一些病原微生物如利士曼原虫、单纯疱疹病毒及白念珠菌等感染中，调节性T细胞及细胞因子白细胞介素（IL）-10、转化生长因子（TGF）-β1参与炎症免疫反应并发挥保护性或有害性作用。本研究旨在观察播散性阿萨希毛孢子菌病小鼠模型中CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞表达情况，并探讨其可能发挥的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种T. asahii标准株（CBS2479）购自荷兰皇家学院真菌多样性中心（CBS）。菌种-80℃保存，接种1个月前经小鼠感染预试验活化。

1.1.2 动物 BALB/c 雄性小鼠，50只，由中国医学科学院动物所提供，体重20～22 g，许可证号：SCXK-2012-0004。随机分为试验组和对照组（各25只）。

1.1.3 试剂 荧光抗体PE-Cy™5 Rat anti-mouse CD4、FITC Rat anti-mouse CD25、Rat anti-mouse Foxp3购自美国BD Biosciences公司；Trizol总RNA提取试剂盒购自英潍捷基（上海）贸易有限公司；FastQuant cDNA第一链合成试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；UltraSYBR Mixture购自北京康为世纪生物科技有限公司；Foxp3和β-肌动蛋白引物由上海生物工程有限公司合成，引物序列如下：Foxp3：5"-TTCGAGGAGCCAGAAGAGTTTC-3"，5"-GGGCCTTGCCTTTCTCATC-3；内参β-肌动蛋白：5"-CC ACAGCTGAGAGGGAAATC-3"，5"-TCTCCAG GGAGGAAGAGGAT-3"。

1.1.4 实验仪器 ST16R高性能通用台式冷冻离心机 （美国赛默飞世尔科技有限公司），型号为BD ACCURI C6流式细胞分析仪（美国BD Biosciences公司），ABI7000实时荧光定量PCR仪（美国应用生物系统公司）。

1.2 方法

1.2.1 接种 挑取单克隆菌落，接种于沙堡培养基（SDA）上培养7 d，以无菌生理盐水冲洗培养基斜面收集菌落，将菌液经12层无菌纱布过滤，血球记数板记数调整孢子悬液浓度为3.2×107cfu/ml。试验组小鼠尾静脉注射菌悬液每只0.3 ml，对照组小鼠尾静脉注射生理盐水每只0.3 ml。

1.2.2 取材 分别于接种后第3，7，14，21及28天，每次每组各取5只小鼠，3.6%水合氯醛（每只0.2～0.3 ml）麻醉小鼠后，超净台解剖小鼠并完整摘取脾脏，无菌生理盐水冲洗干净。

1.2.3 流式细胞仪检测小鼠脾脏单个核细胞中Foxp3+调节性T细胞比率 每次每只小鼠取1/3脾组织，用针栓研磨后200目筛网过滤，PBS洗涤后取100 μl细胞悬液，加入PE-Cy™5 Rat anti-mouse CD4 5 μl，FITC Rat anti-mouse CD25 5 μl，避光 4℃孵育30 min，用PBS 洗去游离的抗体，加红细胞裂解液1 ml，5 min，PBS洗两遍。加入新鲜配制固定/破膜剂1 ml，避光4℃孵育45 min，perm/wash buffer洗2遍，100 μl PBS重悬后加入PE Rat anti-mouse Foxp3 抗体 5 μl，避光 4℃孵育 50 min，PBS洗去游离的抗体，重悬后用流式细胞仪检测CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞占CD4+T淋巴细胞的比率，未与抗体作用的细胞悬液作为空白对照。

1.2.4 实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测小鼠脾脏Foxp3 mRNA相对含量 Trizol提取脾脏组织总RNA，按照FastQuant cDNA第一链合成试剂盒说明书操作步骤合成cDNA，应用SYBR Green染料法，通过ABI7000定量PCR仪检测。以相同的cDNA扩增目的基因，分别取cDNA 1 μl加入PCR八连管，依次加入UltraSYBR Mixture 10 μl,目的基因上下游引物各 0.5 μl，无菌蒸馏水 8 μl，构成 20 μl反应体系，每个样品做3次重复。扩增条件：95℃预变性10 min，变性95℃10 s，退火60℃30 s，延伸72℃32 s，共40个循环。结果根据目标基因和内参基因β-肌动蛋白得到的Ct值，采用2-△△Ct法进行样品间相对定量分析。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 小鼠脾脏单个核细胞Foxp3+调节性T细胞比率

试验组小鼠脾脏单个核细胞中CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞占CD4+T细胞的比例第3天为（7.33±0.49）%，与对照组（7.73±0.61）%相比，差异无统计学意义（P＞0.05）；第7 天为（9.93±0.91）%，较对照组出现明显上升（7.90±0.40）%，差异有统计学意义（P＜0.05）；第14天达到高峰，为（15.13±1.06）%，与对照组（7.60±0.56）%相比，差异有统计学意义（P＜0.05）；其后逐渐下降，第21天为（11.03±0.85）%，与对照组（7.60±0.96）%相比，差异有统计学意义（P＜0.05）；第28天降至正常水平（8.23±0.50）%，与对照组（7.53±0.51）%相比，差异无统计学意义（P＞ 0.05）（图 1，2）。

图1 不同感染时间小鼠脾脏组织CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞流式细胞图

图2 不同感染时间小鼠脾脏CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞占CD4+T细胞比例

2.2 小鼠脾脏Foxp3 mRNA表达情况

试验组小鼠脾脏Foxp3 mRNA表达水平第3天为（1.36±0.31），较正常对照组（1.13±0.41）升高，但差异无统计学意义（P＞0.05）；第7天为（1.90±0.23），较对照组（1.30±0.37）升高，差异有统计学意义（P＜ 0.05）；第 14天 为（2.59±0.55），较正常对照组（1.40±0.36）升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；第21天为（1.93±0.23），与对照组（1.38±0.36）相比，差异有统计学意义（P＜ 0.05）；第 28天 为（1.26±0.22），与对照组（1.18±0.07）相比，差异无统计学意义（P＞ 0.05）（图 3）。

图3 不同感染时间小鼠脾脏Foxp3 mRNA表达水平

3 讨论

调节性T细胞通过抑制效应T细胞增殖及细胞因子的产生来维持免疫内环境稳态[8]。在一些真菌感染性疾病中，调节性T细胞数目增多或功能增强，一方面可以避免过度炎症反应对感染部位造成的病理性损伤，对机体起到保护性作用；另一方面，调节性T细胞抑制有效免疫应答同时减弱机体清除病原微生物的能力，从而导致感染持续存在[9]。调节性T细胞发挥免疫抑制作用主要通过两种途径：①通过细胞-细胞直接接触抑制多种效应细胞及抗原提呈细胞的活化与功能。调节性T细胞膜表面组成性地高表达负性调节因子细胞毒素T淋巴细胞抗原-4(cytotoxin T lymphocyte antigen，CTLA-4)，CTLA-4可以与辅助性T淋巴细胞（helper lymphocyte T，Th）细胞表面共刺激分子CD28竞争性结合共刺激配体B7，在适应性免疫应答后期下调T淋巴细胞的活化。②分泌抑制性细胞因子作用于效应T淋巴细胞，如IL-10、TGF-β1。IL-10不仅可以抑制Th1细胞合成干扰素（IFN）-γ，还可以抑制单核/巨噬细胞、树突状细胞抗原提呈能力，具有抑制炎症反应的发展和减轻炎症损伤的作用[10]。TGF-β1可以抑制巨噬细胞和NK细胞活化，阻断活化T细胞的增殖和IL-2的产生，同时能促进诱导性调节性T淋巴细胞的分化，促进损伤组织的修复[11]。有研究发现，在白念珠菌、烟曲霉、副球孢子菌的感染过程中，调节性T细胞及细胞因子IL-10、TGF-β1表达增高并抑制过度炎症反应，从而发挥保护性或有害性作用[12-14]。笔者既往研究也发现，IL-10、TGF-β1参与小鼠T. asahii感染后免疫应答反应，可能减弱了机体清除T. asahii的能力，为T. asahii的存活提供了有利条件[15]。

T. asahii引起的播散性感染会导致全身免疫系统的改变，为探讨调节性T细胞在T. asahii引起的播散性感染中作用机制，笔者对播散性毛孢子菌病小鼠脾脏中调节性T细胞及其转录因子Foxp3 mRNA表达水平进行测定，结果发现试验组小鼠在接种菌悬液后第7天，脾脏CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞及Foxp3 mRNA表达水平开始较正常对照组明显升高，差异有统计学意义；在第14天达到最高值（最高可达正常对照组2倍），其后逐渐下降，至第28天下降至正常水平。以上研究结果表明，T. asahii可以诱导小鼠体内CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞在感染中后期表达增高，调节性T细胞可能参与调节播散性毛孢子菌病的免疫应答反应，这与白念珠菌、烟曲霉、副球孢子菌等研究结果相似[12-14]。本研究结果表明，调节性T细胞参与小鼠播散性毛孢子菌病感染免疫应答反应。调节性T细胞可能抑制了机体抵御T. asahii感染的有效免疫应答反应，减弱了机体清除T. asahii的能力，为阿萨希毛孢子菌的存活提供了有利条件。但调节性T细胞在播散性毛孢子菌病中发挥的确切免疫效应及具体作用机制仍需进一步体内和体外实验研究。