消银汤治疗银屑病小鼠模型的实验研究

史 勇 李冬梅 肖井雷

(长春大学特殊教育学院,长春130022)

银屑病(Psoriasis，PS)俗称牛皮癣，中医称之为“白疕”，是一种常见的易于复发的慢性炎症性皮肤病，特征性损害为红色丘疹或斑块上覆有多层银白色鳞屑，银屑病主要病理改变为表皮增生分化异常、真皮乳头毛细血管增生扩张和炎症细胞浸润[1，2]。增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)和血小板内皮细胞黏附分子(CD31)在细胞增生、分化及血管形成过程中起重要调控作用[3，4]。本研究通过建立银屑病动物模型，观察中药消银汤治疗后银屑病小鼠血清及皮损区PCNA、VEGF和CD31的表达及分布特点，为探讨银屑病的发病机制及消银汤的广泛临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1主要试剂及仪器 消银汤由长春中医药大学药学院提供，其主要成分：黄芪10 g，生地15 g，牡丹皮12 g，赤芍15 g，半枝莲30 g，白化蛇舌草15 g，槐花10 g，紫草10 g，玄参15 g，丹参15 g，鸡血藤15 g，甘草6 g；用水煎煮2次，煎煮合并浓缩液每剂168 ml(1 g/ml)，每天摄入量2.8 g/kg(成人60 kg)。十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate，SDS)购于北京鼎国生物有限公司；RNA提取试剂Trizol购于Invitrogen公司；RNA反转录试剂盒、Taq酶和DL 2000 marker购于塔克拉公司； 兔抗鼠PCNA、VEGF和CD31一抗购于Abcam公司；SP9710和DAB显色试剂盒购于福州迈新生物有限公司；Biotek Epoch酶标仪；实时荧光定量PCR仪(ABI7300)、Biometra PCR扩增仪(Biotek公司，美国)；OLYMPUS BX51显微镜(OLYMPUS公司，日本)。

1.2方法

1.2.1实验动物分组及给药 BALB/c雌性小鼠(合格证号：SCXK辽2015-0001)50只随机分为对照组、模型组、消银汤低、中和高剂量组，每组10只。消银汤组采用灌胃方式给予消银汤17.3、34.5和69.0 g/kg，对照组及模型组均每日灌胃给予等剂量的生理盐水，每天2次，连续治疗14 d，然后处死取血液和皮肤组织。

1.2.2动物模型制备[5]实验前1 d全部小鼠背部皮肤去毛(3 cm2)；次日模型组和消银汤各剂量组小鼠背部去毛处皮肤均匀涂抹10% SDS 2 ml，1次/d，共7 d制备模型；对照组小鼠给予蒸馏水同样涂抹7 d。

1.2.3样本采集和检测指标 各组动物在实验结束后次日清晨处死，取血液及皮肤组织，一部分于4℃冰箱暂存待测，一部分固定于10%福尔马林液，每组取10个样品。

1.2.3.1小鼠皮损组织的病理学观察 苏木精-伊红(HE)染色后，通过OLYMPUS BX51显微镜观察。

1.2.3.2小鼠血液和皮损组织中PCNA、VEGF和CD31 mRNA水平的检测 采用实时荧光定量PCR法检测，引物的设计和合成由上海生物工程有限公司提供。PCNA上游引物：5′-GACACATACCGCTGCGATCG-3′，下游引物：5′-TCACCACAGCATCTC-CAATAT-3′，片段307 bp；VEGF上游引物：5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游引物：5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′，片段260 bp；CD31上游引物：5′-AGCGTTGAGCCAAGTGTAGAC-3′，下游引物：5′-ATGCTCATGCACGTCCGTGCAT-3′，片段287 bp。每个样本基因扩增3次，取样本得Ct值均值，采用2-ΔΔCt表示目的基因相对表达水平。

1.2.3.3小鼠皮损组织中PCNA、VEGF和CD31蛋白的阳性表达强度的检测 采用免疫组织化学方法，阳性表达呈棕黄色，细胞核复染为蓝色。通过Motic Images Advanced 3.2图像分析软件分析，蛋白阳性表达强度用光密度值(OD值)表示，OD值越大阳性表达越强。

2 结果

2.1各组小鼠皮损组织的病理改变 HE染色200倍镜光学显微镜下观察可见，正常组小鼠：表皮较薄排列规则，真皮层未见淋巴细胞浸润。模型组：与对照组及三个治疗剂量组比较，表皮明显增厚，真皮层淋巴细胞浸润多见。消银汤高、中、低剂量组：与对照组比较，表皮均略增厚，真皮层偶见淋巴细胞浸润，高、中、低剂量组在病理改变方面未见明显差异，均能使表皮变薄，减轻病变造成的炎症反应。各组小鼠皮肤的附属器均未见异常，见图1。

2.2各组小鼠皮损组织中PCNA、VEGF和CD31蛋白的阳性表达强度 200倍镜光学显微镜下观察与对照组比较，模型组小鼠皮肤组织中PCNA、VEGF和CD31的蛋白阳性表达强度(OD值)均显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，消银汤各组小鼠皮肤组织中PCNA、VEGF和CD31蛋白的阳性表达强度(OD值)随剂量增加显著降低，且差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1。

2.3各组小鼠皮肤组织和血清中PCNA、VEGF和CD31的mRNA水平 与对照组比较，模型组小鼠皮肤组织和血清中PCNA、VEGF和CD31 mRNA水平均显著升高， 差异有统计学意义(P<0.05)； 与模型组比较，消银汤各组小鼠皮肤组织和血清中PCNA、VEGF和CD31的mRNA水平随剂量增加其降低趋势显著，且差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

GroupsmRNA level of skin lesions tissuePCNAVEGFCD31mRNA level in serumPCNAVEGFCD31Control group6.33±0.9511.02±1.418.37±1.464.06±0.796.13±0.927.22±1.04Model group16.91±1.281)21.45±2.831)22.52±3.031)8.89±1.311)13.25±2.071)15.01±3.651)Low dose group13.09±1.021)2)17.42±2.511)2)15.19±2.071)2)7.16±1.151)2)10.64±1.811)2)12.36±2.941)2)Medium dose group11.16±1.351)2)3)14.08±1.621)2)3)12.86±2.141)2)3)6.08±1.291)2)3)8.35±1.421)2)3)10.03±1.921)2)3)High dose group8.69±0.971)2)3)4)11.74±1.392)3)4)10.13±1.371)2)3)4)4.67±0.852)3)4)6.71±0.892)3)4)8.52±1.261)2)3)4)

Note：Compared with control group，1)P<0.05;compared with model group，2)P<0.05;compared with Low dose group，3)P<0.05;compared with Medium dose group，4)P<0.05.

图1 各组小鼠皮肤组织的HE染色、免疫组织化学染色及蛋白阳性表达强度(OD值)的比较

Fig.1 Comparison of HE staining，immunohistochemical staining and protein positive expression in skin tissues of mice in each group

Note: Compared with control group，*.P<0.05;compared with model group，#.P<0.05;compared with Low dose group，△.P<0.05;compared with Medium dose group，▲.P<0.05.

3 讨论

银屑病是一种较常见的易复发的慢性炎症皮肤病，是具有遗传倾向的变态反应性皮肤疾病，目前国内外研究发现银屑病与遗传、感染链球菌、免疫异常、内分泌代谢障碍、环境因素及精神因素等有关，属于多基因遗传的疾病[6-8]。银屑病组织病理学以表皮角化不全、角质形成细胞过度增殖、炎症细胞浸润及新生血管形成为主要特征，其确切病因和发病机制尚不清楚[9]。

PCNA是分子量为36 kD的酸性非组胺核蛋白，仅在增殖细胞中合成或表达[10]。1978 年Miyachi 等[11]首次发现并命名，它在细胞周期G1期开始升高，S期合成达到高峰，M期降至最低。PCNA参与DNA的合成，凡处于增殖期的细胞、组织均可检出PCNA的阳性表达，而处于静止状态的细胞、组织PCNA表达则为阴性，其变化与DNA的合成相一致，因此检测PCNA含量可间接反映局部细胞、组织的增殖状态[10,12]。VEGF又名血管通透因子，由角蛋白细胞分泌，是血管内皮细胞的特异性有丝分裂原，是一种促血管生成的主要调节因子，它通过血管内皮生长因子受体转导其促血管生成的信号，促使血管通透性增加及血管内皮细胞增生、迁移，最终导致新生血管形成，对血管生成具有重要作用，是迄今发现的最强的促进血管内皮细胞增殖、迁移及诱导血管生成的因子[13,14]。CD31主要存在于内皮细胞表面，可反映血管增殖变化及组织形态变化[15,16]。

针对国内外研究发现PCNA、VEGF和CD31是与银屑病皮损病理学相关的基因[3,17]。PCNA、VEGF和CD31在银屑病小鼠皮损处过度表达，会促进表皮细胞过度增殖、角化不全、加速血管增生及增加血管的渗透性，诱发炎症细胞的迁移，从而加重银屑病皮损处的炎症反应，促进银屑病的病理进程，因此降低PCNA、VEGF和CD31在银屑病小鼠皮损处的表达，可能成为银屑病的治疗靶点。

消银汤应用于银屑病治疗发现它具有改善病情、延长缓解期、不良反应小及防止复发的特点[18,19]。综上所述，本实验研究制备银屑病模型小鼠，通过消银汤高、中、低剂量治疗，观察小鼠皮损处表皮厚度、真皮炎症细胞浸润度、PCNA、VEGF和CD31的蛋白及mRNA表达水平，探索消银汤治疗银屑病的作用机制及临床疗效。实验研究发现不同剂量的消银汤能不同程度地抑制银屑病模型小鼠背部皮损的角质细胞过度增殖、真皮乳头层微血管扩张迂曲；能降低小鼠皮损组织、血清中PCNA、VEGF和CD31的蛋白及mRNA水平，高、中、低剂量组差异均有统计学意义(P<0.05)，说明：消银汤能通过下调PCNA、VEGF和CD31的蛋白及mRNA表达水平，明显改善银屑病小鼠的临床症状，为消银汤的临床推广用药和指导其临床用药具有重要意义。