南丹牛Y-SNPs与Y-STRs遗传多样性研究

李秀良， 张俸伟， 曹艳红， 吴柱月， 党瑞华， 李绍波， 陈 宏， 雷初朝*

(1.广西壮族自治区畜牧研究所，南宁530001；2.西北农林科技大学动物科技学院，陕西 杨凌712100)

南丹牛属于役肉兼用地方黄牛品种，中心产区位于广西壮族自治区南丹县境内，以中堡、月里、里湖、八圩4个乡、镇及周边地区为主。南丹县地理位置独特，北接贵州省，西边与云南省比邻。云贵高原在此地地势放缓，由高原向丘陵地带过渡，海拔800～1 000 m，因此南丹县气候条件优越，无严寒酷暑。南丹、天峨、环江等县自古生活着许多少数民族(壮、瑶、苗、彝、仫佬等)，这些少数民族历来就有养牛的习惯，并且每逢红白喜事有杀牛的民族风俗。因此，独特的自然环境和社会条件形成了南丹牛爬坡能力强、适应性好、易于饲养、肉质细嫩、味道鲜美、营养丰富的特色[1-2]。

哺乳动物Y染色体遵循父系遗传，突变率很低，较易产生动物特异的单倍型，能准确地反映动物进化的历史。Y染色体分子遗传标记是研究父系遗传多样性的理想材料，常用的Y染色体标记有Y-SNPs(UTY-19、ZFY-10和USP9Y)和Y-STRs(INRA189和BM861)。使用Y-SNPs确定哺乳动物Y染色体单倍型组，再根据Y-STRs进行各单倍型组内部细化，结合Y-SNPs和Y-STRs区分Y染色体父系起源更加准确[3]。Edwards等[4]利用Y-SNPs(UTY-19和ZFY-10)和Y-STRs(INRA189和BM861)标记研究了138个牛品种的父系遗传多样性，结果表明欧洲家牛属于普通牛(Y1和Y2)，亚洲西南部分布瘤牛Y3单倍型组。

目前，有关南丹牛Y染色体遗传多样性、种群遗传结构的研究未见报道。因此，本研究采用2对Y-SNPs标记(UTY-19和ZFY-10)和2对Y-STRs(NRA189和BM861)分析南丹牛的父系起源，以期为南丹牛的种质资源保护和育种工作提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集和基因组DNA提取

从广西壮族自治区南丹县采集25头南丹公牛耳组织样本，用传统酚氯仿法提取基因组DNA，并将其稀释到10 ng/μL,保存在-20 ℃备用。

1.2 引物合成和PCR扩增

选用侯佳雯等[5]报道的2个家牛Y-SNPs标记(UTY-19和ZFY-10)引物信息和家牛2个经典的Y-STRs位点，即INRA189和BM861标记。由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物。PCR扩增体系为12.5 μL：2×PrimeSTAR Max Premix 6.25 μL引物(10 pmol/L)各0.25 μL，模板DNA 1 μL，超纯水5.25 μL。PCR反应程序为：95 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，36个循环，4 ℃保存。PCR扩增产物由1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3 测序、单倍型组分型及单倍型多样度分析

检验合格的PCR产物由生工生物工程(上海)股份有限公司进行正向测序，使用SeqMan v7.1软件对Y-SNPs的测序结果进行统计，使用GeneMarker V1.91软件对Y-STRs结果进行查看和校正，并用Arlequin 3.0软件进行单倍型多样度(H±SD)计算。

2 结果与分析

通过对25头南丹牛2个Y-SNPs标记(即UTY-19和ZFY-10)PCR扩增产物进行测序，发现UTY-19标记存在C>A颠换，而ZFY-10标记存在C>T颠换和1个GT核苷酸插入/缺失多态位点。以侯佳雯等[5]报道的家牛Y染色体单倍型组判定的标准，并结合2个标记的核苷酸变异确定单倍型组，结果显示，25头南丹牛都属于Y3单倍型组，表明南丹牛全部是瘤牛父系起源。同时利用2个家牛Y染色体特异性微卫星标记INRA189和BM861分析南丹牛Y染色体多态性，结果显示，在INRA189标记中检测到2个等位基因，分别是88 bp和90 bp；在BM861标记中仅检测到1个等位基因，片段大小为156 bp。结合Y-SNPs与Y-STR标记联合分析，在25头南丹牛中共确定了Y3-88-156和Y3-90-156单倍型(表1)，其中Y3-88-156单倍型占优势(92%)，Y3-90-156单倍型的概率很低(8%)。南丹牛的Y染色体单倍型多样度为0.1533±0.0915。

表1 南丹牛Y染色体单倍型组频率及多样度

3 讨 论

Y染色体分子标记是研究家牛父系起源的理想工具，已经被应用于世界各地家牛品种的父系起源研究中。Götherström等[6]对180头欧洲家牛进行Y-SNPs分析，结果表明欧洲家牛是普通牛Y1和Y2起源，其中Y1单倍型组主要分布在北欧，Y2单倍型组集中在南欧。顿珠加才等[7]用2对Y-SNPs(UTY-19和ZFY-10)对西藏地区的西藏牛和日喀则驼峰牛的父系遗传进行研究，结果表明西藏牛包含普通牛Y1、Y2及瘤牛Y3共3种单倍型组；日喀则驼峰牛具有普通牛Y2和瘤牛Y3共2种单倍型组。本研究表明，南丹牛属于瘤牛Y3单倍型组。该结果与雷初朝等[8]提出的中国南方黄牛受瘤牛的影响较大的论述一致。

Y染色体单倍型多样度是评价群体变异程度的重要指标。侯佳雯等[5]利用Y-SNPs标记和Y-STRs标记对皖南牛的父系遗传多样性进行研究，结果表明皖南牛的单倍型多样度是0.218 5。Li等[8]对中国16个黄牛品种302头牛进行研究得出的平均单倍型多样度为0.683 1。本研究发现南丹牛的Y染色体单倍型多样度为0.153 3，低于侯佳雯等[5]对皖南牛的Y染色体单倍型多样度(0.218 5)，同样低于Li等[9]对中国16个地方黄牛品种的平均Y染色体单倍型多样度(0.683 1)，但明显高于李芳玉等[10]对大别山牛的Y染色体单倍型多样度(0)，表明南丹牛的Y染色体遗传多样性较低，这可能与南丹牛的繁殖方式落后有关[11]，也说明南丹牛Y染色体遗传性能稳定，种质资源保存完好。

南丹牛产于温湿山地，经当地人民长期选育和风土驯化，具有耐粗饲、耐热、耐寒和遗传性能稳定等优点[1]。目前，由于农村机械化程度提高，导致优良南丹牛大量作为肉牛饲养与屠宰，使得南丹牛的整体质量下降，个体变小[1,11]。所以应对南丹牛进行全面保种和本品种选育提高，实行异地交换种公牛，防止近亲交配，逐步提高南丹牛的生产性能。