鲜切生菜中荧光假单胞菌生长动力学模型和货架期预测

徐晓霞， 陈安均， 王婷玉， 李家欣， 赵江欣， 李见森， 敖晓琳

（四川农业大学 食品学院，四川 雅安 625014）

鲜切生菜 （fresh-cut lettuce）是新鲜生菜经清洗、切割、包装等加工过程制成的即食产品[1]。鲜切生菜以其新鲜、卫生、方便、环保及健康的特点已成为国内外生菜加工的主流，鲜切生菜凭着自身的优势，将进入一个快速发展的阶段[2-4]。

鲜切生菜在流通过程中极易发生品质变化，且病理因素引起的腐烂变质是品质变化的最主要因素[5]，虽然在不同条件贮藏时受到各类微生物的侵染，但只有部分微生物在腐败中占据主导地位[6]。对鲜切生菜来说，主要是外在因素影响微生物的生长和种类，而温度是最重要的因素[7]，也是加工和储藏过程中最不稳定的环境因素[8]，同时也是惟一不受食品包装类型影响的环境因子[9]。由于鲜切生菜货架期较短，传统的微生物检测方法已经不能满足实际生产的需要，因此开发快速、准确、简便的货架期预测方法是鲜切生菜行业发展的必然趋势[10]。不同温度贮藏鲜切生菜微生物生长模型的建立，已成为鲜切生菜货架期预测的有效方法，同时还可以在很大程度上减少经济损失。

研究人员通过分析发现，温度是对假单胞菌的生长数量影响最大的一个因素[7]。作者利用从鲜切生菜中分离纯化并鉴定得到的优势腐败菌荧光假单胞菌为试验菌株，研究了鲜切生菜不同贮藏温度下的微生物生长情况。通过修正的Gompertz模型建立了荧光假单胞菌的温度生长预测模型，以期快速预测鲜切生菜中荧光假单胞菌的生长，研究了温度对荧光假单胞菌生长速率和延滞期的影响。同时根据一级模型和二级模型建立鲜切生菜的剩余货架期模型，为鲜切生菜剩余货架期预测以及产品安全性评估奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 试验材料 健壮、无机械伤、清洁、成熟度基本一致的新鲜生菜，购买于雅安农贸市场，迅速运回实验室后置于4℃冰箱中备用。

1.1.2 供试培养基 营养肉汤（NB）：北京奥博星生物技术有限责任公司；假单胞菌CFC选择性培养基与选择性培养基添加物：青岛高科技海博生物技术有限公司。

1.1.3 供试菌株 荧光假单胞菌（Pseudomonas fulva）：四川农业大学食品学院果蔬保鲜实验室从不同温度贮藏条件下货架期终点的鲜切生菜中分离纯化并鉴定得到的鲜切生菜的优势腐败菌株。

1.1.4 主要仪器设备 立式自动压力蒸汽灭菌锅GI54DW：致微（厦门）仪器有限公司；生物安全柜HR20-ⅡA2：青岛海尔特种电器有限公司；人工气候箱GZ-380-GSI：韶关市广智科技设备有限公司；生化培养箱BPC-250 F：上海一恒科学仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌悬液的制备 将活化后的荧光假单胞菌接种于无菌营养肉汤中，30℃下摇床培养至稳定期，用5 mL 0.85%的无菌生理盐水对活化后荧光假单胞菌的菌悬液进行离心洗脱，操作重复3次。加入5 mL无菌生理水重悬菌液，涡旋振荡30 s制成菌悬液。用无菌生理盐水2倍稀释菌悬液至合适浓度，于600 nm波长下比色，记录OD值。各稀释浓度均以倾注平板法计数，根据OD值和菌落数绘制标准曲线。将荧光假单胞菌制备成菌悬液后，根据OD值稀释至所需浓度，接种前以平板法计数，以105cfu/mL左右的菌悬液进行接种[11]。

1.2.2 鲜切生菜接种 新鲜生菜经流动自来水冲洗，去除表面杂物，用灭菌的不锈钢刀分成长宽各3 cm左右的块，切分好的生菜4℃无菌蒸馏水清洗3次，在手动果蔬甩干机中甩干后备用。利用微型喷雾器对鲜切生菜喷雾接种，以无菌水作对照处理，取200 g为一组，分为若干组，用0.02 mm聚乙烯保鲜袋包装[11]。

1.2.3 鲜切生菜贮藏与取样 当日对第一组进行微生物计数，其余组分别置于乐扣箱中，分别置于0、4、7、10、15、25 ℃条件下贮藏，每处理分 3 组，实验重复3次，0、4、7℃每24小时取样，10℃每12 h取样，15℃每6 h取样，25℃每5 h取样。

1.2.4 鲜切生菜感官评价 由经过培训的感官评定人员10名对贮藏过程中鲜切生菜的颜色、质地、气味及外型进行感官评分，取平均值，以评价鲜切生菜的质量。生菜的感官评价采用9分制评分法，5分为商品界限，即为货架期终点（感官拒绝点）[12]，结果见表1。

表1 鲜切生菜感官评定标准Table 1 Sensory evaluation standard of fresh-cut lettuce

1.2.5 微生物计数 取样品匀浆，取10 g浆液，加入到90 mL 0.85%灭菌的生理盐水中，充分均质后，10倍梯度稀释。选取合适梯度的稀释液0.1 mL，涂布假单胞菌CFC选择性培养基与假单胞分离琼脂（PIA），每个稀释度做3个平行，吸取0.1 mL空白稀释液作对照，30℃培养48 h，计数结果进行对数转换。

1.2.6 数学模型的建立和验证

1）荧光假单胞菌最小腐败量的确定：微生物的生长能够产生腐败代谢产物，当其达到一定水平导致产品不可接受时的微生物数量即最小腐败量[13]。感官评分和优势腐败菌数量建立线性回归方程，根据感官拒绝分值确定最小腐败量。

2）荧光假单胞菌初级模型的建立：在0、4、7、10、15、25℃条件下贮藏鲜切生菜，得到荧光假单胞菌试验数据。用修正的Gompertz模型通过MATLAB的cftool拟合工具箱拟合得到不同温度下荧光假单胞菌的生长曲线，确定一级模型参数[14]。

修正的Gompertz模型：

最大细菌数量：Nmax=N0+a

式中：N（t）和 N0分别表示 t时微生物数量（lg（cfu/g））和微生物初始数量（lg（cfu/g））；t为时间（h）；λ 为迟滞时间（h）；μmax为微生物生长的最大比生长速率（h-1）；A为稳定期最大菌落数量与初始菌数的差值 （对数值 lg（cfu/g））。

3）温度对荧光假单胞菌生长动力学的影响：平方根模型是不同温度下基于微生物最大比生长速率（μmax）和迟滞时间（λ）与温度之间的线性关系的经验模型[15-16]。利用MATLAB根据下式建立温度对荧光假单胞菌影响的二级模型。

式中，T为培养温度；Tminμ和Tminλ为生长速率为零时的温度值；bμ和bλ为待定系数。

1.2.7 预测模型的验证和评价 利用已建立的数学模型求得7℃和15℃贮藏时鲜切生菜中荧光假单胞菌的预测值，与在7℃和15℃贮藏时荧光假单胞菌实际生长数值对比，利用准确度（Accuracy factor，Af）和偏差度（Bias factor，Bf）来评价所建模型的准确性，对预测模型进行验证，评价已经建立的荧光假单胞菌生长动力学模型的可靠性[17]。Af代表预测值和实际值的相近程度，准确因子在1.1～1.9可以被接受。Bf代表预测值与实际值之间的偏差，偏差因子在0.75～1.25模型可以被接受，可以作为研究该产品品质指标的预测模型[18]。准确度和偏差度的表达式为：

式中，N1为鲜切生菜贮藏过程中检测到的荧光假单胞菌数量；N2为利用荧光假单胞菌动力学预测模型得到的荧光假单胞菌数量；n是试验次数。

1.2.8 鲜切生菜剩余货架期预测模型的建立和验证 基于鲜切生菜荧光假单胞菌生长动力学一级模型和二级模型，应用鲜切生菜初始荧光假单胞菌数量（N0）、最小腐败量（Ns）和最大菌数（Nmax）建立剩余货架期（Shelf life，SL），即从初始微生物数量增值到最小腐败量所需要的时间。货架期预测模型的表达式为：

式中，SL为货架期；λ为迟滞时间（h）；Nmax为最大菌数对数值（lg（cfu/g））（最大菌数的确定采用不同温度下最大菌数的均值）；N0为初始微生物数量对数值（lg（cfu/g））；Ns为最小腐败量（lg（cfu/g））；Nmax为微生物生长的最大比生长速率（h-1）。

将贮藏在7℃和15℃条件下鲜切生菜的实际货架期和鲜切生菜货架期预测模型预测的货架期进行比较，对鲜切生菜剩余货架期预测模型进行验证。

1.2.9 数据处理 感官评分与微生物指标数据采用MATLAB进行相关性分析，微生物计数结果转换为 lg（cfu/g），荧光假单胞菌的试验数据通过MATLAB的拟合工具箱进行拟合。

2 结果与分析

2.1 荧光假单胞菌最小腐败量的确定

鲜切生菜不同温度贮藏条件下感官评分和荧光假单胞菌数（lg（cfu/g））建立线性回归方程，根据感官拒绝分值确定最小腐败量。由表2可知，在不同温度条件下（0、4、10、25 ℃），鲜切生菜的最小腐败量（Ns）平均值为 6.966 3 lg（cfu/g），即货架期终点的荧光假单胞菌数为6.966 3 lg（cfu/g）。

2.2 鲜切生菜中荧光假单胞菌生长动力学模型的建立

根据荧光假单胞菌在 0、4、7、10、15、25 ℃条件下的计数结果，拟合修正的Gompertz模型，绘制不同温度下的生长曲线，结果见图1，拟合参数见表3。结果表明，不同温度下拟合方程相关系数R2分别为 0.990 6、0.994、0.992 6、0.994、0.998、0.991 7，均大于0.95，均方根均小于0.17，方差和均小于0.2，表明修正的Gompertz方程能够很好的拟合不同温度贮藏条件下鲜切生菜中荧光假单胞菌的生长曲线。随着温度的升高，延滞时间（λ）逐渐减小，最大比生长速率（μmax）逐渐增大。

表2 不同温度贮藏鲜切生菜货架期终点荧光假单胞菌数量Table 2 Pseudomonas fulva amounts in the end of shelf life of fresh cut lettuce at different temperature

2.3 温度对荧光假单胞菌生长动力学参数的影响

荧光假单胞菌初级模型的建立不能反映温度变化对鲜切生菜中荧光假单胞菌生长的影响，需采用平方根模型对其进行描述。温度和最大比生长速率（μmax）和迟滞时间（λ）的关系见图2。 温度与最大比生长速率和延滞时间均呈较好的线性关系，最大比生长速率和延滞时间的R2分别为0.978 3和0.979 8，温度对荧光假单胞菌生长最大比生长速率和延滞时间的平方根模型为：

2.4 荧光假单胞菌生长动力学模型的验证和评价

为了定量评价所建鲜切生菜中荧光假单胞菌生长动力学模型的可靠性[20]，对预测模型进行验证，采用准确度 （Accuracy factor，Af） 和偏差度（Bias factor，Bf）来评价所建模型的准确性，利用已建立的数学模型求得7℃和15℃贮藏时，鲜切生菜中荧光假单胞菌的预测值与相应温度贮藏试验中荧光假单胞菌的实际检测值对比，结果见表4。预测模型的准确度和偏差度，结果见表5。

图1 不同温度贮藏鲜切生菜荧光假单胞菌的生长动力学模型Fig.1 Growth kinetic models for Pseudomonas fulva in fresh-cut lettuce at different temperatures

表3 鲜切生菜中荧光假单胞菌的生长动力学参数Table 3 Growth kinetics parameters of Pseudomonas fulva on fresh-cut lettuce

图2 温度与最大比生长速率（μmax）和迟滞时间（λ）的关系Fig.2 Relationship between temperature and maximum specific growth rate（μmax） and lag time（λ）

表4 鲜切生菜在7℃和15℃贮藏时荧光假单胞菌的实测值和预测值Table 4 Predicted and observed values of Pseudomonas fulva on fresh-cut lettuce stored at 7℃and 15℃

表5 鲜切生菜在7℃和15℃贮藏条件下荧光假单胞菌生长预测值的偏差度和准确度Table 5 Bias and accuracy factor of predicted values of Pseudomonas fulva on fresh-cut lettuce stored at 7℃and 15℃

由准确度和偏差度可知，本研究建立的预测模型对不同温度贮藏条件下鲜切生菜中荧光假单胞菌的生长情况预测效果良好。

2.5 剩余货架期的预测和验证

根据2.1可知鲜切生菜的最小腐败量为6.9663 lg（cfu/g），最大菌数根据表3不同温度贮藏条件下最大菌数对数值的平均值8.182 7 lg（cfu/g）为指标。根据建立的优势腐败菌生长动力学模型，应用鲜切生菜初始荧光假单胞菌数量（N0）、最小腐败量（Ns）和最大菌数（Nmax）建立剩余货架期，即从初始微生物数量增值到最小腐败量所需要的时间，鲜切生菜剩余货架期模型为：

将贮藏在7℃和15℃条件下鲜切生菜的货架期和鲜切生菜货架期预测模型预测的货架期进行比较，对鲜切生菜剩余货架期预测模型进行验证。

表6是鲜切生菜在7℃和15℃条件下贮藏时货架期实测值和预测值的对比结果，相对误差分别为-12.53%和8.65%。研究表明，食品微生物预测模型误差在±25%以内的模型即可作为可靠的预测工具。因此，本试验所建立的鲜切生菜剩余货架期的预测模型具有较好的可靠性，能够有效的预测鲜切生菜的剩余货架期。

表6 鲜切生菜在7℃和15℃贮藏时货架期的实测值和预测值Table 6 Predicted and observed shelf life for fresh-cut lettuce stored at 7℃and 15℃

3 结语

应用Gompertz模型建立了不同温度条件贮藏鲜切生菜荧光假单胞菌的生长曲线和模型。

0 ℃：N （t）=4.431 4+3.135exp{-exp[0.015 2×(40.528-t)+1]}

4 ℃：N（t）=4.431 4+3.01exp{-exp[0.018×(29.254 7-t)+1]}

10 ℃：N（t）=4.431 4+3.828exp{-exp[0.045 5×(7.535 1-t)+1]}

25 ℃：N （t）=4.431 4+5.032{-exp[0.117 4×(2.385-t)+1]}

应用Belehradek模型建立了温度对鲜切生菜中荧光假单胞菌最大比生长速率和迟滞时间的关系，方程分别为：

根据建立的鲜切生菜中荧光假单胞菌的生长动力学模型求的7℃和15℃贮藏时的预测值，与相应温度下荧光假单胞菌的实际检测值对比来对模型进行验证，准确度和偏差度分别为1.014 9、0.995 9和1.005 6、1.002 3，建立的预测模型可以很好的预测鲜切生菜中荧光假单胞菌在7℃和15℃下的生长动态。

根据建立的优势腐败菌生长动力学模型，建立了鲜切生菜的剩余货架期的预测模型：

将贮藏在7℃和15℃条件下鲜切生菜的货架期实际值和预测值对比，相对误差分别为-12.53%和8.65%，表明所建的鲜切生菜货架期预测模型能够真实有效地预测鲜切生菜的剩余货架期。

目前，在畜肉、水产品等食品冷链流通领域中[21-22]，已有应用特定腐败菌生长预测模型预测产品剩余货架期的研究报道，但是在鲜切生菜中的应用报道较少。有研究对酸性电解水处理鲜切生菜及气调包装鲜切生菜中需氧细菌、大肠杆菌类、蜡样芽孢杆菌、菌落总数等进行了动力学方面的研究[23-24]。唐坚[25]采用Gompertz模型建立了贮藏期间生菜的微生物生长模型方程，在一级模型的基础上得到了低温下的货架期预测模型。张立奎等[26]研究了鲜切生菜在不同贮藏温度下鲜切生菜中菌落总数的变化，建立了相应的Gompertz函数模型。本研究建立了鲜切生菜的剩余货架期模型，为鲜切生菜货架期的快速预测奠定基础。同时，本研究仅建立了鲜切生菜中荧光假单胞菌的温度预测模型，建议下一步研究包含更多自变量的预测模型，同时采集更多的生长数据，为鲜切生菜建立更准确更可靠的货架期预测模型。