C-erbB-2 与KRAS 基因在结直肠癌中的表达及其相互关系

潘理会 李育庄 李春辉

1承德医学院血流变研究室（河北承德067000）；承德医学院附属医院2神经内科，3病理科（河北承德067000）

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一，其发生、发展与多种基因突变及其所构成的细胞信号传导的调控异常有关，其中表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）介导的RAS/RAF/MAPK 信号传导通路在肿瘤的发生、发展中发挥着重要作用［1］。表皮生长因子受体-2（C-erbB-2）与EGFR 同源，二者具有高度相似的生物学特性；KRAS 是RAS 基因家族中与人类肿瘤关系最为密切的一种表现形式，为C-erbB-2 信号通路下游的重要效应分子。目前，有关处在同一信号通路上的C-erbB-2与KRAS 在肿瘤中的表达及与其与肿瘤生物学行为的关系倍受关注，本研究分别采用FISH 法和实时荧光定量-PCR 法检测CRC 组织中C-erbB-2 基因的扩增和KRAS 基因的突变，为判断患者预后及靶向治疗的潜在靶点提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2012年12月至2016年10月间承德医学院附属医院行结直肠癌根治术并经病理证实的CRC 蜡块标本共238 例（所选取标本术前均未经任何放化疗治疗且均具备完整病理资料）。在238例CRC 中，男124例，女114例；≤58岁89 例，＞58 岁149 例（中位年龄58 岁）；右半结肠癌39 例，左半结肠癌52 例，直肠癌147 例；非黏液腺癌201 例，黏液腺癌37 例；高分化52 例，中分化154 例，低分化32 例；有淋巴结转移175 例，无淋巴结转移63 例；Duke′s 分期A 期47 例，B 期82 例，C期71 例，D 期38 例；浸润黏膜层及黏膜下层17 例，浸润肌层74 例，浸润浆膜层147 例。

1.2 实验方法

1.2.1 FISH 检测法切取石蜡切片3 μm 厚，置硅烷玻片上65 ℃过夜，常规脱蜡至水化；50 ℃下30%酸性亚硫酸钠处理切片30 min；200 μg/mL 蛋白酶K 37 ℃消化30 min；-20 ℃预冷的70%、85%、100%乙醇梯度脱水2 min，再丙酮浸泡脱脂2 min；探针混合液73 ℃预热5 min 滴加10 μL 于玻片上42 ℃杂交过夜，甲酰胺洗涤，自然干燥；滴加15 μL DAPI 复染，静置20 min，荧光镜检。

1.2.2 FISH 结果判断标准癌细胞核呈蓝色荧光信号，C-erbB-2 基因位于核内，呈红色荧光信号；17 号染色体着丝粒位于核内，呈绿色荧光信号。随机计数30 个肿瘤细胞，计算红绿比值。比值≥2.2 判断为（＋），即C-erbB-2 基因扩增；比值＜1.8判断为（－），即C-erbB-2 基因未扩增，比值介于1.8 ～2.2 之间，则选择增加计数细胞数目或重做实验来确定判最终结果。

1.2.3 实时荧光定量PCR切取石蜡切片10 μm厚5 片，常规脱蜡水化，1 张用于HE 染色镜下观察形态，其余用于DNA 提取，显微镜下观察HE 切片选取肿瘤成分超过70%区域刮入裂解液，充分混均；1 300 r/min离心10 min，吸取上清。紫外分光光度计测量DNA 质量和浓度。从试剂盒中取出阳性质控品和Tag 酶室温融化，混均后2 000 r/min 离心15 s；分别向45 μL待测样品DNA（浓度约2 ng/μL）、阳性对照、阴性对照（NTC）中加入2.25 μL Tag 酶，混均后2 000 r/min 离心15 s，放在PCR 管架上，轻轻揭开反应条管盖，将混好的DNA 样品依次取5 μL 加入PCR 反应条中，盖紧管盖，移至PCR 仪检测。反应循环参数为：预变性95 ℃5 min，1 个循环；95 ℃25 s、64 ℃20 s、72 ℃20 s，15 个循环；93 ℃25 s、60 ℃35 s、72 ℃20 s，31 个循环。反应体系为25 μL。在第3 阶段60 ℃时收集信号，保存文件。

1.2.4 实时荧光定量PCR 结果判断标准以无模板对照扩增曲线的最高点为准设定阈值。没出现扩增曲线或Ct 值为0 的标本为（-）；出现扩增曲线且Ct ≤26.0 的标本为（+）；26.0 ≤Ct ≤28.0 的标本为可疑阳性，需重复检测。

1.3 试剂与仪器石蜡组织DNA 提取试剂盒及C-erbB-2 基因扩增检测试剂盒与KRAS 12、13 密码子基因突变检测试剂盒由福建厦门艾德生物医药科技有限公司生产。Mx3000P 实时荧光定量PCR仪为美国Stratagene 公司产品。

1.4 统计学方法使用SPSS 16.0 统计学软件进行数据处理，组间比较应用χ2检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CRC 中C-erbB-2 扩增及与病理特征的关系238 例CRC 中有4 例发生C-erbB-2 扩增，总扩增率为1.7%（4/238）。C-erbB-2 扩增与年龄、性别、肿瘤位置、组织学分类、分化程度、淋巴结转、Duke′s 分期及浸润深度等病理参数，组间差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1 和图1、2。

图1 CRC 组织中C-erbB-2 FISH 检测发生扩增Fig.1 Amplification of C-erbB-2 in FISH of colorectal cancer

图2 CRC 组织中C-erbB-2 FISH 检测未发生扩增Fig.2 Non amplification of C-erbB-2 in FISH of colorectal cancer

表1 CRC 中C-erbB-2 扩增及KRAS 突变与病理参数的关系Tab.1 C-erbB-2 amplification in the colorectal cancer and the relationship between the KRAS mutations and pathological characteristics

2.2 CRC 中KRAS 突变及与病理参数的关系238 例CRC 中有88 例发生KRAS 突变（图3），总突变率为32.3%（88/238）。KRAS 突变与淋巴结转移和Duke′s 分期明显相关，在淋巴结转移组和无淋巴结转移组突变率分别为47.4%（83/175）、36.5%（23/63）（P = 0.043），组间差异有统计学意义；在Duke′s 分期A、B、C、D 期突变率分别为23.4%（11/47）、31.7%（26/82）、42.3%（30/71）、50.0%（19/38）（P = 0.019），组间差异有统计学意义；与其他临床病理特征比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

图3 KRAS 基因突变图Fig.3 The amplification plots of KRAS gene mutation

2.3 CRC 中C-erbB-2 扩增与KRAS 突变间的相关性相关分析显示，C-erbB-2 扩增与KRAS 突变没有相关关系（P = 0.076，表2），但238 例CRC 中有4 例C-erbB-2 扩增，在4 例C-erbB-2 扩增中有1例KRAS 突变，3 例未发生突变，二者突变重叠率为25%，在234 例C-erbB-2 扩增中有85 例KRAS 突变，149 例未发生突变，二者重叠比例为57%，可见，二者存在正相关关系。

表2 CRC 中C-erbB-2 扩增与KRAS 突变的相关性Tab.2 The amplification of C-erbB-2 and the mutations value of KRAS in colorectal cancer

3 讨论

原癌基因C-erbB-2 它定位于17 号染色体q11-21 上，其结构同EGFR 蛋白的氨基酸排列顺序具有50%左右的同源性，因此C-erbB-2 与EGFR 二者具有相同的蛋白激酶活性，并在控制细胞得分裂及分化中起着非常重要的作用；KRAS 基因当其发生异常改变时，则导致细胞的过度持续生长，并且能阻止细胞自我毁灭的发生，由于细胞内的信号通路的改变，当KRAS 基因发生突变时，该基因就发生了永久活化，进而导致细胞内信号传导的改变，使细胞过度增殖、失控而导致癌的发生。C-erbB-2 是一种细胞来源的原癌基因是EGFR 家族成员之一，其激活后可通过不同信号转导通路参与对细胞的生长、增殖、分裂及凋亡的调控［1-2］，有学者研究证实C-erbB-2 基因的扩增程度在CRC中比正常大肠黏膜高，并且C-erbB-2 基因的扩增程度在CRC 中随着CRC 组织学分级程度的加重C-erbB-2 基因扩增也逐渐的向高拷贝转移，组织学分级越低的CRC，C-erbB-2 基因扩增越强，由此说明C-erbB-2 基因的扩增可以在一定程度上反映着CRC 的恶性转化以及其生物学的行为，也就是说CRC 的恶性转化以及其生物学的行为有赖于C-erbB-2 基因的活化［1，3］，另外，也有学者研究证实，CRC 患者C-erbB-2 基因的扩增在有淋巴结转移者明显强于无淋巴结转移者，也就是说CRC 淋巴结转移与C-erbB-2 基因扩增有密切关系，CRC中C-erbB-2 基因扩增使CRC 侵袭、转移的能力增强，提示CRC 患者预后不良，这也揭示了C-erbB-2基因的扩增有可能成为CRC 患者预后参考指标，具有重要的理论意义和实际意义［4-6］。本研究的结果显示C-erbB-2 基因的扩增与CRC 患者的性别、年龄、CRC 的部位、CRC 分期、CRC 分化程度、CRC 组织学类型、是否有淋巴结转移以及Duke′s分期无关，这个结果提示C-erbB-2 基因的扩增未参与CRC 的分化及侵袭转移，与患者的预后无关，导致上述结果的原因可能是C-erbB-2 基因的扩增对CRC 预后的影响较弱，并且CRC 本身预后较差，使C-erbB-2 基因的扩增对CRC 预后影响表现的不够稳定，得出这样的结果，因此如果C-erbB-2 基因发生扩增，那么患者就可用靶向药进行分子靶向治疗，表明C-erbB-2 基因的扩增是应用分子靶向治疗的主要依据，C-erbB-2 基因的扩增不能作为分子靶向治疗独立的指标，同时C-erbB-2 基因的扩增也不能作为判断CRC 的预后的单一指标，与肿瘤发生有关的RAS 基因家族成员有3 种，即分别定位在11、12 和1 号染色体上的HRAS、KRAS、NRAS 基因，KRAS 基因又称p21 基因，其是编码为21 kD 的RAS 蛋白。在RAS 基因家族中，KRAS 基因与人类癌症的发生、发展关系最为密切，它就如一个分子开关：当其在正常生理状态时可调控细胞生长的传导路径；当其发生异常改变时，则导致细胞的过度持续生长，并且能阻止细胞自我毁灭的发生，由于细胞内的信号通路的改变KRAS 基因可以是野生型或突变型，在正常生理情况下，细胞受到外界刺激后激活EGFR 等信号通路，野生型KRAS 被活性的EGFR 短暂活化，活化的KRAS 激活该信号传导通路中的下游信号组件蛋白，使KRAS 迅速的失活，在正常情况下KRAS 激活或失活效应是受控的。KRAS 突变型蛋白可导致蛋白功能异常，在无EGFR 活化信号刺激的情况下仍处于激活状态，那么它的功能状态则不可控，就导致肿瘤的持续增殖，继而导致肿瘤的发生、发展，KRAS 是RAS 家族成员之一，参与C-erbB-2 信号通路的传导，KRAS 基因是最常见的突变基因之一［7-13］，KRAS 基因突变与肿瘤生物学行为的关系，各家报道众说不一，分歧较大。王璇等［14］报道CRC 中KRAS 突变率为38.8%，与性别及淋巴结转移有关。MANNAN 等［15］报道CRC 中KRAS 突变率高达50%，与淋巴结转移和肿瘤分期显著相关性，也有研究认为KRAS 突变比较频繁，在患者的结肠肿瘤中时常出现突变［16-17］，沙如拉等［18］和常江等［19］报道CRC 中KRAS 突变率分别为37.8%和36.6%，与所有临床病理指标均无明显相关，本研究与上述部分结果相符。本研究显示CRC中KRAS 总突变率为32.3%；与淋巴结转移和Duke′s 分期显著相关，在有淋巴结转移组和无淋巴结转移组中KRAS 突变率分别为47.4%和36.5%，两组之间差异有统计学意义，这一结果表明KRAS 在肿瘤细胞向癌旁及系膜组织的局部侵润及转移中发挥着重要作用，KRAS 突变率的高低可作为临床评估肿瘤侵袭性、转移力、患者预后的重要参考指标；在Duke′s 分期的A、B、C、D 期KRAS 突变率依次为23.4%、31.7%、42.3%、50.0%，两两间差异有统计学意义，KRAS 突变越高，浸润深度越深，这一结果表明KRAS 在肿瘤细胞向肠壁浸润的过程中起着一定作用。

C-erbB-2 和KRAS 同 为RAS/RAF/MAPK 信 号通路的上下游调控因子，C-erbB-2 可通过与家族中其他受体酪氨酸激酶形成异源二聚体发生磷酸化，募集下游信号蛋白SH2 和Grb2，活化调控分子SOS，随之依次活化RAS 和RAF，最后级联激活MAPK，将传导信号转入核内活化转录因子，导致细胞过度增殖、异常分化、引发癌变［20-21］。从理论上讲C-erbB-2 和KRAS 具有协同作用。关于CRC中C-erbB-2 和KRAS 表达相关性的研究未见报道，本研究对C-erbB-2 扩增和KRAS 突变进行相关分析，发现二者表达并无相关关系；然而在本研究中检出的4 例C-erbB-2 扩增中有发生1 例KRAS 突变，不难看出随着样本量的增大过表达量也会相应增加，表明C-erbB-2 扩增和KRAS 突变可发生在同一肿瘤组织中，且呈正相关，推测C-erbB-2 自身作用可能对CRC 的发生、发展影响不大，而通过激活下游信号分子进而刺激信号传导通路的持续活化而发挥作用，也就是说两者基因在肿瘤的发生发展中起着协同作用。对C-erbB-2 和KRAS 之间的调控机制还需要进一步的临床研究和综合资料的论证分析。